Стратегия выделения нового гена
Выделить требуемый ген и заставить его работать в новых для него генетических условиях проще всего в случае бактериальных и вирусных генов, поскольку геном этих микроорганизмов невелик. Кроме того, бактериальные гены, как правило, не содержат интронов и даже гетерологичные бактериальные гены хорошо экспрессируются в клетках E. coli. При клонировании эукариотического гена необходимо решить, нужна ли экспрессия рекомбинантного гена в клетках микроорганизмов или же можно ограничиться исследованием его структуры? Очевидно, что в первом случае нужно думать о создании клонотеки безинтронных кДНК, а во втором - клонотеки геномной ДНК исследуемого объекта, что технически менее сложно. Если отсутствуют сведения о первичной структуре клонируемого гена, то источником получения информации о последовательности его нуклеотидов может быть кодируемый этим геном белок.
Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов, которые далее используют для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два-три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующейся с олигонуклеотидными зондами, можно идентифицировать кодируемый кДНК белок после ее экспрессии с использованием специфических антител. Или кодирующий потенциал клонированной кДНК определяют после ее гибридизации с суммарной мРНК, выделяя фракцию мРНК, задерживаемой иммобилизованной кДНК на носителе, с последующей трансляцией мРНК в бесклеточной белоксинтезирующей системе. Кроме того, если клонированная кДНК кодирует мРНК исследуемого белка, то они и в растворе образуют специфический ДНК-РНК-гибрид, и мРНК перестает участвовать в трансляции в бесклеточной системе (метод прерванной трансляции). Наличие или отсутствие белкового продукта бесклеточной трансляции легко обнаружить с помощью специфических антител.
После проведения таких исследований можно точно идентифицировать клонированную кДНК и использовать ее в качестве зонда для выделения целого гена из клонотеки геномной ДНК. Одновременно возможна экспрессия клонированной кДНК в клетках микроорганизмов или в гомологичных эукариотических клетках.
Уникальной задачей является клонирование неизвестных генов, действие которых можно заметить по сложным фенотипическим признакам, например, симптомам системного наследственного заболевания. При выделении таких генов из генома человека работа начинается с проведения анализа сцепления исследуемого фенотипического признака и какого-либо полиморфного молекулярного маркера, например, редкого аллеля HLA или минисателлитного локуса всех членов семьи больного. После обнаружения сцепленных маркеров задача сводится к клонированию крупных фрагментов ДНК, включающих эти маркеры, их секвенированию, выявлению открытых рамок считывания, в которых пытаются обнаружить мутации, отсутствующие у здоровых индивидуумов.
