Субтилигаза в лигировании пептидов
Конструирование белков с новыми свойствами основано на использовании молекулярно-генетических методов направленного мутагенеза , которые не позволяют осуществить встраивание в полипептидные цепи неприродных аналогов аминокислот или других веществ, что ограничивает возможности исследований белков. Такие модификации можно было бы вносить в процессе химического синтеза пептидов, однако в этом случае невозможно получать пептиды большой длины из-за накопления побочных продуктов синтеза.
Поэтому был разработан альтернативный подход к химическому синтезу длинных пептидов, заключающийся в ферментативном лигировании синтезированных химическими методами коротких пептидов друг с другом. Этот подход стал возможен благодаря созданию с помощью направленного мутагенеза аналога субтилизина, так называемого субтилизина BPN', катализирующего образование пептидных связей в водных растворах. Такой мутантный фермент, получивший название субтилигазы, содержит в своей полипептидной цепи две мутационные замены: Ser заменен на остаток Cys, а Pro - на Ala. Первая замена в активном центре субтилизина резко повышает его способность к аминолизу (образованию пептидной связи) по сравнению с гидролитической активностью при использовании в качестве субстратов тетрапептидных эфиров. Вторая мутация изменяет конформацию мутантного активного центра, компенсируя стерические эффекты, вызванные введением остатка Cys, что еще более улучшает каталитические свойства фермента.
Д. Джексоном с соавторами (1994 г.) разработана стратегия синтеза крупных полипептидных цепей с использованием субтилигазы, реализованная в синтезе модифицированной рибонуклеазы А, обладающей ферментативной активностью. На первом этапе синтеза был получен полностью незащищенный пептид, представляющий собой C-концевой фрагмент РНКазы А, и он был использован в дальнейшем в качестве акцепторной молекулы ( см. схему стр.401 ).
Следующий N-концевой донорный фрагмент полипептидной цепи этерифицирован по С-концу гликолат-фенилаланиламидом (glc-F-NH2).
Полученный эфир эффективно ацилируется субтилигазой, что отражает особенности ее субстратной специфичности: фермент предпочитает использовать в качестве субстрата эфиры, в которых освобождается группа glc-F-NH2. В отличие от этого донорный пептид содержит на N-конце дополнительную изоникотиноильную защитную группу, что предотвращает его лигирование самого на себя. Такая группа вводится на последней стадии твердофазного синтеза пептидов и проявляет устойчивость к разбавленной плавиковой кислоте (HF), которая использовалась для снятия защиты с боковых цепей пептидов и отщепления самих пептидов от твердого носителя. После каждого лигирования пептидов изоникотиноильную группу удаляли в условиях мягкого восстановления (в присутствии цинка и уксусной кислоты) для освобождения NH2-группы - необходимой участницы очередного цикла лигирования.
Исходя из субстратной специфичности субтилигазы (фермент эффективно использует крупные гидрофобные донорные субстраты и малоэффективен с отрицательно заряженными остатками аминокислот или остатками пролина, попадающими в его активный центр), карту полипептидной цепи РНКазы А разделили на шесть фрагментов. Эти фрагменты были синтезированы и лигированы друг с другом в соответствии с вышеприведенной схемой с выходом, достигающим 70% на каждом этапе.
В результате была получена полноразмерная полипептидная цепь РНКазы А (124 аминокислотных остатка), которая после спонтанного фолдинга приобрела искомую ферментативную активность. В ходе синтеза отдельных пептидов исследователи заменили два остатка His, находящихся в активном центре фермента (положения 12 и 119), на остатки 4-фторгистидина. Поскольку это производное His обладает pKa = 3,5 (pKa His = 6,8), у искусственной РНКазы А наблюдали резкий сдвиг в оптимуме pH реакции гидролиза субстрата без заметных изменений kкат, что было особенно неожиданным результатом, позволившим сделать интересные выводы о механизме ферментативной реакции, осуществляемой РНКазой А. Позднее субтилигаза была успешно использована для синтеза модифицированного гормона роста человека и циклических пептидов.
