Химический мутагенез
Методом введения большого числа точковых мутаций разной локализации в исследуемые части генов in vitro является химический мутагенез одноцепочечных участков рекомбинантных ДНК. Принцип метода заключается в том, что некоторые химические мутагены, такие как бисульфит натрия, гидроксиламин или метоксиламин, действуют только на одноцепочечные участки ДНК. Следовательно, получив молекулы ДНК, содержащие одноцепочечные бреши в исследуемых участках генов, можно с помощью бисульфита натрия дезаминировать остатки цитозина в этих участках, т.е. превратить их в остатки урацила. После достройки цепи такой мутагенизированной молекулы ДНК с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli происходит замена исходных G-С-пар на T-U. Затем мутагенизированные молекулы ДНК с помощью трансформации вводят в бактериальные клетки, где по завершении первого раунда репликации в молекуле осуществляется замена остатков U на T и полная замена G-С-пары на A-T, т.е. имеет место обычная транзиция.
Одноцепочечные мутагенизированные участки ДНК получают путем гибридизации одноцепочечной ДНК вектора с двухцепочечной ДНК того же вектора, содержащего клонированный ген или его участок, который необходимо мутагенизировать. В образующемся гибриде-гетеродуплексе, одна цепь которого принадлежит вектору без вставки, а другая - вектору со вставкой, происходит выпетливание последовательности вставки в виде одноцепочечного участка ДНК.
Последующий отбор мутантов на основе новых биохимических или иных параметров мутантных белков (исчезновение, ослабление или усиление ферментативной активности, появление новой активности или новых иммунологических свойств и т.п.) позволяет идентифицировать остатки аминокислот в исследуемых белках, отвечающие за эти изменения.
Химический мутагенез накладывает ограничения на спектр возникающих мутаций, так как лишь определенные остатки нуклеотидов ДНК претерпевают изменения, поэтому многие мутации не могут быть получены с помощью химических мутагенов. Проблему можно частично решить, используя для репарации одноцепочечных брешей ДНК аналоги нуклеотидов, например N-гидроксицитозинтрифосфат, который в составе ДНК одинаково хорошо спаривается с A и G, или создавая такие условия, при которых репарирующая ДНК-полимераза начинает ошибочно включать в синтезируемую цепь ДНК некомплементарные матрице нуклеотиды.
Мутагенизированные молекулы ДНК из одной реакционной пробирки представляют собой сложную смесь, в которой каждая молекула несет несколько независимо возникших мутаций. Для введения мутаций в определенный локус исследуемого гена необходимо проводить процедуру отбора, сопряженную с анализом большого числа мутантов.
