CBC: роль в сплайсинге пре-мРНК
Кэп-структура m7G необходима для эффективного сплайсинга пре-мРНК в бесклеточных экстрактах клеток животных. Установлено, что сплайсинг пре-мРНК с одним интроном подавляется в присутствии экзогенных аналогов кэпа или кэп-содержащих РНК. Резкое ингибирование сплайсинга наблюдали в экстрактах, истощенных с помощью специфических антител по большой субъединице CBC - CBP80. Изучение этого явления показало, что гетеродимерный CBC требуется для эффективного сплайсинга кэпированных пре-мРНК. Во время сплайсинга больших пре-мРНК кэп-группа оказывает влияние лишь на вырезание ближайшего к ней интрона.
На рис. I.16в представлены результаты опытов, демонстрирующих данное явление. В экспериментах использовали искусственные кэпированные пре-мРНК с двумя интронами, которые содержали один или несколько мутантных канонических сайтов сплайсинга в разных комбинациях. Инактивация 5'-концевого сайта сплайсинга первого интрона не оказывала влияния на вырезание второго интрона и блокировала вырезание первого ( рис. I.16,в,2 ). Мутация в ближайшем к кэп-группе 3'-концевом сайте сплайсинга сопровождалась вырезанием большой последовательности, включающей оба интрона и второй экзон, расположенный между ними ( рис. I.16,в,3 ). Такая конструкция процессировалась как пре-мРНК, содержащая только один интрон, вырезание которого зависело от наличия комплекса CBC. При инактивировании как 3'-, так и 5'- концевой сайтов сплайсинга первого интрона, вырезание второго интрона происходило независимо от CBC (в истощенных по комплексу экстрактах). Лишь одновременное разрушение 5'-концевого сайта сплайсинга и полипиримидиновой последовательности первого экзона сопровождалось появлением CBC-зависимости вырезания второго интрона ( рис. I.16,в,4 ).
Полученные данные показывают, что именно полипиримидиновая последовательность, а не 5'-концевой сайт сплайсинга первого экзона, обеспечивает кэп-независимое вырезание второго интрона. Принимая во внимание, что CBC необходим для эффективного взаимодействия U1-мяРНП с 5'-концевым сайтом сплайсинга ближайшего к нему интрона, предполагают, что полипиримидиновая последовательность, расположенная перед центральным экзоном, выполняет аналогичные функции при определении этого экзона системой сплайсинга.
