Инсуляторы: свойства
Способность последовательностей нуклеотидов ДНК выполнять функции инсуляторов определяют в функциональных генетических тестах по их способности обеспечивать экспрессию генов, искусственно интегрированных в хромосому ( трансгенов ), независимо от локализации сайта интеграции. В качестве гена-репортера при определении активности инсуляторов часто используют ген white дрозофилы , поскольку изменение уровня его экспрессии сопровождается легко измеряемым изменением окраски глаз у трансгенных мух, которая может меняться от красного, у организмов дикого типа, до белого у нуль-мутантов, при полном подавлении экспрессии мутантного гена.
Обнаружена эволюционная консервативность инсуляторов и регуляторных белков, взаимодействующих с ними. В частности, LCR- последовательности бета-глобинового гена цыплят эффективно функционируют в этой системе в качестве инсуляторов.
Одной из наиболее хорошо изученных последовательностей нуклеотидов, обладающей свойствами инсулятора, является транскрибируемый нетранслируемый участок ДНК ретротранспозона gypsy у дрозофилы, содержащий сайты связывания белка-супрессора Hairy-wing (su(Hw)) .
Структурно-функциональный анализ инсуляторов в системе с геном white показал, что последовательности участков инсуляторов, гиперчувствительных к ДНКазе I, необходимы для их функционирования, тогда как центральная А/T-богатая область, устойчивая к действию нуклеазы, для этого не требуется. Удаление части последовательностей из гиперчувствительных сайтов сопровождается понижением активности инсуляторов, тогда как простое увеличение числа копий последовательностей восстанавливает их активность. Активность пограничных последовательностей может обеспечиваться определенным критическим количеством молекул связавшихся с ними белков, неспецифичных в отношении типа инсулятора, которые могут действовать на энхансеры либо непосредственно, либо через изменение структуры хроматина.
При создании модели действия инсулятора необходимо объяснить все известные свойства инсуляторов:
- инсулятор блокирует взаимодействие между энхансером и промотором только в том случае, если находится между ними;
- инсулятор может блокировать взаимодействие между любым энхансером и промотором, т.е. не существует специфичности действия инсулятора;
- изолированные инсулятором энхансер и промотор сохраняют функциональную активность;
- эффективность действия инсулятора прямо пропорциональна количеству сайтов связывания для одного ДНК-связывающего белка.
Также следует принять но внимание тот факт, что инсуляторы могут функционировать в составе плазмид [ Krebs J.E., Dunaway M., 1998 ]. При этом для эффективного блокирования энхансера в составе кольцевой плазмиды необходимы две копии инсулятора с обеих сторон от энхансера.
Для бета-глобинового инсулятора было также показано, что он может блокировать энхансер на линейной плазмиде при условии, что расположен между энхансером и промотором [ Recillas-Targa F. et al., 1999 ].
Не решен вопрос о способности MAR/SAR-последовательностей , разделяющих функциональные домены хроматина, выполнять функции пограничных последовательностей. Не все SAR-последовательности способны подавлять эффект положения. Например, свойствами инсуляторов обладают соответствующие последовательности гена тяжелой цепи иммуноглобулина, а также генов лизоцима цыплят, бета-интерферона и аполипопротеина B человека. В последнем случае сайты прикрепления ДНК к ядерным мембранам расположены за 5 т.п.о перед точкой инициации транскрипции и на 43 т.п.о. ниже этой точки, на границах между конденсированной и открытой формами хроматина. Последовательности, располагающиеся в этих участках хроматина, обладают повышенной чувствительностью к ДНКазе I и обеспечивают правильную экспрессию интегрированного в хромосомы гена-репортера в клетках-трансфектантах гепатомы , вызывая 200- кратную стимуляцию его транскрипции, не зависимую от локализации места интеграции. Это означает, что данные 3'- и 5'-концевые MAR APOB-локуса человека обладают всеми свойствами пограничных последовательностей . Функционирование SAR-последовательностей в качестве инсуляторов в ряде случаев не является конститутивным, но зависит от типа клеток и стадии развития организма. Например, SAR-последовательности гена бета-интерферона человека , фланкирующие мышиный ген теплового шока HSP70.1 , функционируют как инсуляторы в клетках эмбрионов мышей на стадии предимплантации, но не в дифференцирующихся тканях новорожденных и взрослых трансгенных мышей. Видимо, топологические домены хромосом, выделяемые MAR/SAR-последовательностями, не являются статическими образованиями, а могут изменяться в процессе индивидуального развития организма, что сопровождается изменением характера экспрессии больших блоков генов в дифференцирующихся клетках.
