ГЕНЕТИКА СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК К АНАЛИЗУ ДЕЙСТВИЯ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ
В настоящее время исключительно плодотворными оказались исследования, которые на первом этапе проводятся на клеточном уровне с использованием методов генетики соматических клеток, а затем - на уровне организма с анализом действия генов у животных. Разрушение (нокаутирование) гена и анализ выключения его действия на эмбриональное и постнатальное развитие животного представляется для анализа функции гена весьма точным, так как оно позволяет нокаутировать оба аллеля данного гена и тем самым полностью выключить его действие. Этот метод получил в настоящее время очень широкое распространение. Нокаутирование осуществляется с помощью гомологичной рекомбинации , вследствие которой активно экспрессирующийся ген полностью инактивируется и появляются null-аллели [ Тарантул ea 1996 ].
Последовательность событий такова. Используются эмбриональные стволовые клетки ( ES-клетки ) на стадии предимплантационной бластоцисты . Эти клетки еще не дифференцированы и плюрипотентны. В клетки, сохраняющие типичную недифференцированную морфологию, различными способами ( электропорация , Са-фосфатный метод , с помощью ретровирусов ) вводят векторы, которые содержат последовательности, гомологичные последовательностям гена, предназначенного для выключения. Внутрь этих последовательностей (10-15 kb) вставлен ген, обычно это ген neo (определяющий резистентность к неомицину и антибиотику G418 ), который должен нокаутировать эндогенный ген-мишень. Часто вектор содержит ген ТК вируса простого герпеса . Такая конструкция позволяет использовать специально разработанную систему позитивно-негативной селекции, при которой клетки, претерпевшие негомологичную рекомбинацию, погибают, а клетки, в которых произошла гомологичная рекомбинация, образуют колонии в селективной среде. Следует отметить, что после первого тура гомологичной рекомбинации клетка гетерозиготна по нокаутированному гену, поэтому применяют еще один раунд позитивно-негативной селекции. Существуют различные модификации позитивно-негативной селекции [ Свердлов ea 1996 , Тарантул ea 1996 ].
Далее от эксперимента, проводимого на клеточном уровне с помощью методов генетики соматических клеток, переходят к опытам на уровне организма. Клетки, претерпевшие гомологичную рекомбинацию, вводят в бластоцисту, которую затем имплантируют в матку ложнобеременной самки [ Свердлов ea 1996 ]. В качестве мышей-доноров бластоцист обычно выбирают таких, которые отличаются по генам окраски шерсти, имеющимся у ES. Например, ES-клетки несут ген черной окраски (черная окраска доминантна), тогда в качестве донора бластоцист используют рецессивных альбиносов. В потомстве мыши, которой вводили такие бластоцисты, будут рождаться химерные особи, у которых на шкурке появятся как белые, так и черные участки. Если при скрещивании таких мышей с альбиносами появятся черные потомки, это будет означать, что введенная через стволовые клетки генетическая информация включилась в клетки зародышевого пути мыши-реципиента. Мыши F1 будут гетерозиготны по нокаутированному гену, и путем соответствующих скрещиваний получают гомозиготных животных [ Свердлов ea 1996 ].
В последние годы предложен метод, позволяющий исследовать эффект нокаутирования гена только в совершенно определенных клетках, т.е. изучать тканеспецифнчность его действия [ Barinaga ea 1994 ]. Все эти методы позволяют определить роль исследуемого гена в поддержании нормальной жизнедеятельности организма через выключение его функции [ Hilberg ea 1993 ].
В табл. 2 приведены некоторые примеры влияния null-аллелей на эмбриональное и постнатальное развитие мышей. В настоящее время исследовано уже действие многих сотен генов in vivo, работы проводятся в многочисленных лабораториях разных стран.
