Открытие клеточных онкогенов

Оригинальные исследования конца 70-х-начала 80-х годов полностью подтвердили положение о том, что признаки трансформированного фенотипа закодированы в ДНК [ Copper ea 1982 ]. Классическими работами в этом направлении являются работы Вейнберга с соавт. [ Shih ea 1981 , Shih ea 1979 ]. Была выделена ДНК из клеток карциномы мочевого пузыря человека EJ и трансфецирована в псевдонормальные клетки NIH ЗТЗ мыши. Эти клетки- реципиенты способны к неограниченно длительному размножению, что свойственно малигнизированным клеткам, но они не обладают другими типичными признаками трансформированного фенотипа - способностью размножаться при малом процентном содержании сыворотки в среде, т.e. уменьшением потребностей в ростовых фактоpax, способностью роста в полужидком агаре без прикрепления к субстрату, отсутствием контактного торможения (прекращение деления при соприкосновении клеток друг с другом), ростом многослойных колоний - и не образуют опухолей при прививке сингенным мышам или мышам nude. Согласно представлению о многоэтапности процесса канцерогенеза клетки NIH ЗТЗ прошли, по- видимому, только первый этап на пути превращения нормальной клетки в злокачественную. После трансфекции ДНК из клеток карциномы мочевого пузыря человека в культуру клеток ЗТЗ появлялись типичные для трансформированных клеток многослойные колонии [ Shih ea 1979 ]. ДНК, выделенная из таких колоний, передавала этот признак при повторных циклах трансфекции, что полностью подтверждало представление о кодировании признаков трансформированного фенотипа в ДНК [ Shih ea 1981 ].

С целью идентификации гена, обладающего трансформирующей активностью, в клетках карциномы использовали в качестве зондов последовательности различных вирусных онкогенов: установлена гомология с вирусным геном v-Ha-ras , а затем с c-Ha-ras крысы [ Parada ea 1982 ].

Было показано, что клеточный онкоген, выделенный из опухоли, подобно вирусным онкогенам, обладает мутагенной активностью в культуре клеток [ Бобрышева ea 1992 , Baron ea 1992 ]. Ген c-Ha-ras был секвенирован, и анализ структуры таких активированных ras-генов показал, что появление трансформирующей активности определяется, главным образом, точковыми мутациями [ Feig ea 1988 ] в двух "горячих точках" - в кодонах 12 и 61 [ Barhacid ea 1987 , Fasano ea 1984 ].

Таким образом, активация гена ras и превращение его из протоонкогена в онкоген приводит к изменению структуры его продукта, т.е. к качественным изменениям.

Целый ряд опухолей грызунов и человека содержат активированные онкогены, способные вызывать злокачественную трансформацию при трансфекции [ Copper ea 1982 ]. Следует, однако, отметить, что индукция трансформации после трансфекции позволила выявить главным образом онкогены семейства ras , куда входят такие гены, как Ki-ras и N-ras [ Shimisu ea 1983 ], а также несколько других онкогенов. Если злокачественная трансформация, вызываемая геном ras, определяется преимущественно изменением структуры их продукта за счет точковых мутации, то ряд протоонкогенов приобретают трансформирующую активность, т.е. дейстуют как онкогены , в результате повышения уровня экспрессии и количества продукта. Часто это связано с возникновением {bх}bромосомных перестроек. В настоящее время показано, что для целого ряда опухолей характерны специфические хромосомные аберрации [ Погосянц, 1983 ]. Наиболее показательным примером активации протоонкогена за счет увеличения уровня транскрипции вследствие хромосомных перестроек является ген c-myc . Известно, что при В-клеточной лимфоме Беркита обнаружены три типа транслокаций. Наиболее типичная транслокация -это I (8:14) , при которой ген c-myc, локализованный в хромосоме 8 человека, оказывается перенесенным на хромосому 14 в локус тяжелой цепи иммуноглобулина. При транслокациях t(2;8) и 1(8:22) ген c-myc переносится в локусы легких цепей. В результате ген с-тус оказывается под контролем регуляторных элементов активно транскрибирующихся генов иммуноглобулинов. Доказательством активации c-myc в результате транслокаций является возможность получения малигнзированных линий после трансфекции плазмидой, содержащей активированный c-myc [ Rabbits T.H., Rabbits P.H., 1989 ]. Следует подчеркнуть, что помимо увеличения экспрессии в результате транслокаций в них обнаружены также различные генные мутации. Таким образом, активация этих генов может быть следствием не только гиперэкспрессии, но и структурных изменений в их продуктах в результате возникающих точковых мутаций [ Rabbits T.H., Rabbits P.H., 1989 ]. Гиперэкспрессия может быть вызвана и амплификацией генов. Цитологически амплификация выражается в появлении двойных микрохромосом и гомологично окрашивающихся участков хромосом. Есть много примеров амплификации протоонкогенов в различных опухолях. Приведем лишь два примера клеточных линий, в которых наблюдалась амплификация: c-myc ( линия HL60 ) - от больного с промиелоцитарным лейкозом и c-adl ( линия Л562 ) - от больного хроническим миелолейкозом [ Rabbits T.H., Rabbits P.H., 1989 ].

На основе изучения амплификации были обнаружены ранее неизвестные онкогены, в частности N-myc в клетках нейробластомы и L-myc в клетках мелкоклеточного рака легкого [ Johnson ea 1988 , Schwab ea 1983 ].

Как и вирусные, клеточные онкогены могут обладать разными функциями. Так, действие c-myc определяет так называемую иммортализацию клеток , в результате которой клетки, обладающие ограниченным сроком жизни в культуре, приобретают способность неограниченно долгого роста. Вместе с тем не способен вызвать морфологическую трансформацию и образование многослойных колоний. Таким образом, c-myc индуцирует только первый этап превращения нормальной клетки в злокачественную. В отличие от c-myc, под влиянием c-ras образуются многослойные колонии, что говорит об отсутствии у них контактного торможения , типичного признака трансформированного фенотипа. Действие каждого из этих генов по отдельности не приводит к появлению полностью злокачественного фенотипа и тем более прививаемости у животных. Для этого необходимо комплементирующее действие онкогенов, обладающих разными функциями, что еще раз подтверждает представление о многоэтапности канцерогенеза .