Анализ колоний E.coli
Фрагмент колонии клеток E.coli суспендировали в 24 мкл смеси для ПЦР. Для ПЦР реакций (объем 25 мкл) использовали следующую реакционную смесь:
матрица - суспензия клеток (0,5-1мкл)
праймер прямой - 0,4 мкМ
праймер обратный - 0,4 мкМ
дезоксинуклеотидтрифосфаты - 0,125 мМ каждый
буфер Taq-полимеразы - х1
Taq-полимераза - 0,5 ед.акт.
MgCl2 - 1,5 мМ
mQ - до нужного объема.
Поверх смеси наслаивали 50 мкл легкого минерального масла.
Реакцию амплификации проводили в режиме:
Денатурация: 95*С - 5'
Денатурация: 95*С - 25'' x25
Отжиг праймеров: 60*С - 25'' x25
Синтез: 72*С - 45''.
В качестве контроля проводилась реакция с плазмидной ДНК.
Для дальнейшей работы с клоном колонию пересевали в 5-10 мл жидкой среды LB с ампициллином (100 мкг амп/мл LB).
