Биологическая активность вещества X и переход X->N
Мы проверили, действительно ли микроцин "X" является конечным или промежуточным продуктом созревания микроцина Б , или же это артефакт выделения. Независимые эксперименты подтверждают, что микроцин X производится in situ. Во-первых, экспресс-MALDI-MS анализ производящих микроцин клеток, обработанных 70% ацетонитрилом и раствором матричного соединения (2,5-дигидроксибензойной кислоты) показал, что эти клетки содержат вещество с массой 3094 и с характерным X-пиком фрагментации ( рис. 20 ). Во-вторых, при кипячении микроцина N в 0.1 М растворе уксусной кислоты в течении 20 минут (имитация процедуры выделения) не было замечено никаких следов образования вещества X. Ряд экспериментов был выполнен, для того, чтобы оценить антибактериальную активность веществ X и N подтвердить, что они имеют одну и ту же мишень ( рис. 21 ). Используя стандартный тест (ингибирование роста газона чувствительных клеток в мягком агаре) на активность микроцина, мы показали, что равные концентрации веществ X и N приводят к образованию зон ингибирования роста одинакового размера. Зоны ингибирования роста для обоих веществ уменьшаются сходным образом на газонах клеток E. coli, несущих в gyrB мутации, дающие частичную устойчивость к микроцину (gyrB Trp751->Arg) [ 138 ]. Клетки у которых отсутствует транспортер микроцина через внешнюю мембрану - SbmA - полностью устойчивы к обоим соединениям [ 139 ]. В качестве контроля мы использовали ципрофлоксацин, другой антибиотик, который ингибирует ДНК-гиразу , но взаимодействует с другими участками фермента и не требует SbmA для входа в клетки [ 140 ].
Двухцепочечные разрывы в ДНК, вызываемые микроцином и ципрофлоксацином , приводят к активации у клеток состояния SOS-ответа, при котором активируется транскрипция генов, в норме репрессированных регулятором транскрипции LexA [ 140 , 17 , 141 ]. Используя клетки, содержащие LexA-зависимый промотор sfiA, слитый с репортерным геном lacZ [ 19 ], мы определили способность двух форм микроцина вызывать SOS-ответ. Для этого мы оценивали цвет вокруг зон ингибирования роста тестерного штамма в мягком агаре, приготовленном на среде МакКонки. Обе формы микроцина и ципрофлоксацин, но не ингибитор аминоацил-тРНК-синтетазы микроцин С, приводят к появлению ободков интенсивного красного цвета вокруг зон ингибирования роста клеток, демонстрируя, что у клеток, получающих сублетальные дозы микроцинов X и N и ципрофлоксацина, активируется SOS-ответ. Эксперименты на газонах чувствительных клеток подразумевают длительные (ночь) инкубации микроцина на поверхности агара при pH 7, что потенциально способно приводить к переходу "X" в "N" во время определения активности вещества. Результаты химической модификации микроцина X при pH 7.4 подтверждают эту возможность. Хроматографический анализ микроцина X, инкубированного ночь при pH 7.4 выявил уменьшение пика микроцина X вместе с образованием дополнительного пика, со временем удерживания характерным для микроцина N. Приблизительно 20% микроцина X перешло в N-форму в данных условиях ( рис. 22 ). Тем не менее, накопление относительно небольшого количества вещества N не может отвечать за наблюдаемую биологическую активность вещества X, так как одинаковая активность обоих веществ наблюдалась в условиях, далеких от насыщения. Чтобы продемонстрировать, что вещества X и N имеют одну и ту же мишень, были исследованы эффекты обоих веществ на катализируемую ДНК-гиразой реакцию суперскручивания ДНК. Добавление ципрофлоксацина и обеих форм микроцина Б вызывало ожидаемое накопление линейной формы ДНК, возникающей из-за опосредованной антибиотиками стабилизации комплексов гиразы с расщепленной ДНК [ 20 ]. Обе формы микроцина стабилизировали комплекс с одинаковой эффективностью ( рис. 21 ). Отсюда был сделан вывод, что X-форма микроцина биологически активна и действует на ДНК-гиразу .
Депсипептидная связь также присутствует в промежуточных продуктах созревания микроцина, имеющих один тиазольный гетероцикл в сайте "В" . Предположительно, он формируется, когда McbBCD синтетазный комплекс модифицирует трипептид Gly-Cys-Ser и завершает синтез тиазольного цикла. В случае сайта "В" фермент с высокой эффективностью переходит к синтезу последующего оксазольного цикла, вслед за этим формируя еще несколько С-концевых оксазолов. В случае сайта "С" , синтез слитого оксазольного цикла (приводящий к появлению вещества дельта+1 ) проходит сравнительно неэффективно. Вместо этого идет конкурирующая реакция N-O-ацильного сдвига, приводящая к накоплению пептида со сложноэфирной связью между Cys51 и Ser52. Возможный механизм этого процесса изображен на рис. 23 .
Известно, что McbBCD-комплекс взаимодействует с субстратом обратимо при образовании каждого цикла, но в то же время синтез гетероциклов происходит последовательно, от N к C концу. Нам кажется вероятным, что все присутствующее в клетках вещество N может являться продуктом обратной изомеризации N-O связи. Косвенно на это указывает кинетика накопления различных форм микроцина при росте культуры производящих клеток: вещество X накапливается быстрее, чем N и дельта+1. Тем не менее, нельзя и отвергнуть возможность "пропуска" синтетазой серина в трипептиде Gly-Cys-Ser.
Можно заметить, что процесс гетероциклизации сходен с процессами, происходящими при автопротеолизе и белковом сплайсинге [ 142 , 143 ]. При этом нуклеофильное присоединение гидроксила серина к Сальфа атому приводит к формированию неустойчивого аддукта, который в дальнейшем может изомеризоваться разными способами. О-протонирование приводит к образованию оксазолинового цикла, тогда как N-протонирование - к формированию сложноэфирной связи. (В случае автопротеолиза эта связь подвергается дальнейшей трансэстерификации и в итоге расщепляется.)
