Выделение микроцина из клеток E. coli и ВЭЖХ-анализ
В среде LB (10 мл) с добавлением необходимых антибиотиков выращивались ночные насыщенные культуры E. coli DH5альфа, несущиеплазмиды с mcb опероном. На ледующей день 0.5 л минимальной среды М63 с добавлением нужных антибиотиков и сукцината натрия в качестве источника углерода инокулировалось данными культурами. Культуры на минимальной среде выращивались сутки при 37*С. Клетки собирали центрифугированием и лизировали 10-минутным кипячением в 20 мл 0.1М уксусной кислоте с добавлением 1 мМ ЭДТА. Лизат центрифугировали 10 мин при 10000 об/мин и наносили супернатант на картридж с С18 смолой для предварительной очистки (SepPack C18, Thermo Scientific). Картридж промывали 0.1% ТФУ и 10% MeCN/0.1% ТФУ для удаления примесей флавоноидов. Фракцию, содержащую микроцин Б, элюировали с картриджа 25% MeCN/0.1% ТФУ, высушивали и перерастворяли в DMSO. Образец наносили на колонку ВЭЖХ (XTerra C18 250x4.6 мм, Waters) в виде 10% DMSO/0.1% ТФУ и хроматографировали в условиях градиентной элюции (линейный градиент MeCN от 0-20% за 10 мин, 20-27% за 20 мин). Фракции, содержащие микроцин Б, выходили между 18 и 25 минутами. Изучаемые фракции высушивались и перерастворялись в 50% MeCN/0.1% ТФУ.
