Ингибирование репликации в пермеабилизованных клетках E. coli
Ночной культурой клеток MC4100 дельтаsbmA инокулировали 25 мл среды LB и растили до OD600=0.5-0.7. Клетки осаждали, промывали в 50 мМ фосфатном буфере pH 7.4 и ресуспендировали в 1 мл этого же буфера. Клетки пермеабилизовали замораживанием в жидком азоте с последующим оттаиванием в водяной бане на 30*С. Сразу же после оттаивания к 14 мкл клеток добавляли 55-58 мкл деионизованной воды (mQ), 18 мкл буфера для синтеза ДНК (230 mМ Трис-НСl pH 7,5; 22 mМ MgCl2; 714 mМ KCl; 4mМ АТP; 0,1 mМ бета-меркаптоэтанол; 200 микроМ каждого dNTP) и микроцин до концентрации 100 микроМ. Пермеабилизованные клетки инкубировали с изучаемыми микроцинами 20 мин при 30*С, после этого добавляли меченый альфа-dATP 5 микроCi и продолжали инкубацию. Через равные промежутки времени (каждые 15 минут, включая нулевую точку) отбирали аликвоты по 20 мкл в которых реакцию останавливали добавлением 200 мкл холодной 10% ТХУ. 200 мкл из каждой аликвоты наносили на нитроцеллюлозные фильтры 0,45 микроM и промывали 4 мл холодной 0,01 N соляной кислоты для того, чтобы избавиться от невключенной метки. Фильтры высушивали, радиоактивность на фильтрах оценивали с помощью фосфоимаджера.
