Исследование ингибитора ДНК-гиразы микроцина B: реактивы и ферменты
В работе были использованы:
I. Реактивы: этиловый спирт, изопропиловый спирт, гидроксид натрия, гидроксид калия, ацетат аммония, ацетат натрия, ацетат калия, ампициллина натриевая соль, вазелиновое масло, гидрофосфат натрия, хлорид калия, уксусная кислота, однократно перегнанный фенол, хлороформ (квалификация "хч" и "осч", Россия), агароза LE 2 (Helicon); смесь фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1), USB, США; ацетонитрил (Криохром, Россия, сорт "1"); бромфеноловый синий (Bio- Rad, США); бромистый этидий (Sigma, США); дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Boehringer, Германия); додецил сульфат натрия (SDS) (Sigma, США); глицерин (Sigma, США); этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) (Sigma, США); дитиотриэтол (Sigma, США); хлорид магния (Merck, Германия); изопропил-bD-тиогалактопиранозид (IPTG) (Sigma, США); 5-Бром-4-хлор-3-индолил-b-D-галактопиранозид (X-Gal) (Promega, США); ДНК-маркеры длин 1 т.п.о. (1 kb DNA Ladder) и 100+1500 п.о. (100 bp DNA Ladder) (SibEnzyme, Россия); наборы для очистки продуктов ПЦР PCR purification Kit, Gel Extraction Kit (Qiagen); системы выделения плазмидной ДНК PureLink Quick Plasmid Miniprep (Invitrogen, США), Plasmid Midi Kit (Qiagen, США); система для клонирования продуктов ПЦР pGEM-T Vector System Promega, США); диметилсульфоксид (DMSO) Panreac; трифторуксусная кислота (ТФУ) (Sigma, США); хлорид магния (Merck, Германия), сукцинат натрия Amresco(США); дрожжевой экстракт (Helicon, Россия); триптон (Amresco, США); трис(гидроксиметил)аминометан (Трис) - Amresco, США.
II. Препараты, меченные радиоактивными изотопами: [альфа-32P+ATP (>5000 Ки/ммоль) - ГНЦ РФ ФЭИ, Обнинск, Россия.
III. Ферменты: термостабильные ДНК-полимеразы: HS-Taq (Евроген, Россия), PfuTurbo (Stratagene, США); ДНК-топоизомераза I E. coli (NEB, США); ДНК-лигаза бактериофага Т4 (NEB); T4 полинуклеотидкиназа (NEB); эндонуклеазы рестрикции DpnI, NotI, SmaI, ApaI, BamHI (NEB); протеиназа К (Promega, США), экзонуклеаза бактериофага Т5 (Epicentre, США); ДНК-гираза E. coli (Inspiralis, Великобритания).
IV. Буферные растворы:
- Буфер ТЕ (10x) - 0.1 М Трис-Cl (pH 8.0), 10 мМ ЭДТА
- Буфер ТAЕ (50x) - 2 М Трис, 2 М уксусная кислота, 50 мМ ЭДТА
- Фосфатный буфер (PBS) (10X) - 17мМ KH2PO4, 52мМ Na2HPO4, 1,5М NaCl
- Лигазный буфер (10x) - 300 мМ трис-HCl (pH 7.8), 100 мМ MgCl2, 100 мМ дитиотриэтол (DTT), 10 мМ ATP.
- Буфер для нанесения образцов ДНК на агарозный гель - 40% сахароза, 100 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА, 0.1% бромфеноловый синий.
V. Микробиологические среды:
- LB: 10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л NaCl. Среду автоклавировали 30 мин при давлении 1.2 атм.
- SOB: 20 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 мM NaCl, 2.5мM KCl.
- M63: KH2PO4, pH 7 - 100 мM, (NH4)2SO4 -15 мМ, FeSO4 - 1.8 мкМ,MgSO4 - 1 мМ, тиамин - 1 мкг/мл, сукцинат натрия - 5 г/л. Компоненты среды стерилизовали отдельно и смешивали в стерильных условиях.
VI. Бактериальные штаммы. В работе были использованы следующие клеточные линии E. coli: B; DH5альфа; ZK195 (BW25113 дельтаsmbA); MG1655 gyrB W751R; MG1655; CSH50 sfiA::lacZ 50
