Микроцин B: механизм действия
Внутриклеточной мишенью микроцина Б является ДНК-гираза . Добавление микроцина Б в реакцию сверхспирализации, катализируемую ДНК-гиразой in vitro, приводит к накоплению двуцепочечных разрывов. Механизм ингибирования ДНК-гиразы микроцином Б точно не известен, также как и участок фермента, с которым взаимодействует микроцин [ 23 ]. Микроцин Б взаимодействует с комплекcом ДНК-гиразы с ДНК, не образуя при этом прочных связей ни с ДНК-гиразой, ни с ДНК вне комплекса. Считается, что микроцин Б связывается с субъединицей GyrB вблизи ДНК-ворот (единственная на сегодняшний день мутация устойчивости к микроцину - GyrB W751R - попадает в эту область) и стабилизирует комплекс ДНК-гиразы с расщепленным G-сегментом ДНК, что приводит к ингибированию реакции лигирования этого сегмента. Накопление тупиковых комплексов микроцина с гиразой и ДНК блокирует движение ДНК-полимеразы [ 131 ]. По-видимому, область ДНК-гиразы, с которой взаимодействует микроцин Б, отлична от тех областей, с которыми связываются хинолоны и кумарины , так как мутаций, приводящих к перекрестной устойчивости к этим антибиотикам не наблюдается. Этот факт обуславливает перспективность использования производных микроцина Б в медицине.
Механизм действия микроцина отличается от механизма действия хинолонов . В противоположность хинолонам vикроцин Б ингибирует сверхспирализацию и релаксацию ДНК только частично, вернее он замедляет эти реакции. In vitro было показано, что микроцин замедляет реакции сверхспирализации и релаксации, проводимые ДНК-гиразой, в три раза при температуре в 25 градусов по С. В то время как хинолоны увеличивают скорость образования обоих разрывов в G-сегменте ДНК, микроцин Б ускоряет образование только второго разрыва. Кроме того, микроцин незначительно стабилизирует переходный комплекс в отсутствие АТФ и существенным образом при наличии АТФ в реакции с релаксированной ДНК в качестве субстрата, а стабилизация переходного комплекса хинолонами не зависит от АТФ [ 132 ]. И, наконец, для ингибирования реакции сверхспирализации микроцином Б требуется фрагмент ДНК длиной минимум 150 пар оснований [ 22 ], что не характерно для ингибирования реакции хинолонами и свидетельствует в пользу того, что образование тупикового тройного комплекса (ДНК-микроцин-фермент) происходит на стадии переноса Т-сегмента через ДНК-ворота гиразы. При этом эффективность переноса Т-сегмента через разрыв в G-сегменте снижается примерно в 3 раза
Мутационный анализ микроцина Б, проведенный исследователями из США и Великобритании, свидетельствует о важности бис-гетероциклов для продукции и бактерицидной активности микроцина Б. Результаты этих авторов указывают на то, что последовательность, кодирующая сайт "A", необходима как для созревания микроцина Б, так и для его бактерицидной активности. Исследователи не обнаружили продукции микроцина Б для мутационного варианта с моногетероциклом в "A"-сайте вместо бис-гетероцикла. Введение точечных мутаций в ген mcbA , элиминировавших бис-гетероцикл в "В"-сайте или превращавших его в моноцикл тоже приводило к утрате микроцином Б бактерицидной активности и способности ингибировать ДНК-гиразу [ 133 , 134 ].
С помощью мутационного анализа было показано, что лидерный пептид микроцина Б, который состоит из двадцати шести аминокислотных остатков, необходим для его созревания, более того для формирования зрелого микроцина этот пептид должен быть ковалентно соединен с остальной частью молекулы. Мутации F8A и L12A лидерного пептида приводили к тому, что гетероциклы микроцина не формировались, значит эти аминокислотные остатки особенно важны для узнавания лидерного пептида синтетазой микроцина Б. Лидерный пептид имеет структуру альфа-спирали, нарушение этой структуры с помощью замены некоторых аминокислот на пролин также препятствовало созреванию микроцина [ 135 ].
Эксперименты in vitro подтвердили, что цистеин первым подвергается гетероциклизации [ 15 ]. Изменение сайта на Gly-Cys-Ser-Gly (обращение порядка Ser/Cys) привело к тому, что двойной гетероцикл не образовывался, и в основном формировалось только соединение с одним тиазольным кольцом. В то же время, последовательность Gly-Cys-Ser успешно подвергается гетероциклизации в другом месте на пептиде. Таким образом, образование гетероциклов зависит от окружающих аминокислотных остатков (контекст-зависимое). Было показано, что для образования первого двойного гетероцикла перед ним должен находиться глицин, замена на аланин (Ala-Ser-Cys) препятствовала образованию гетероцикла. Меньший эффект давала замена C-фланкирующего глицина.
Было показано, что остатки цистеина циклизуются, в зависимости от своего расположения, от 100 до 1000 раз быстрее, чем остатки серина, что по всей видимости связано с большей нуклеофильностью тиолов по сравнению со спиртами . Образование гетероциклов в микроцине Б также связано с расстоянием. Укорачивание состоящего из 10 глицинов природного линкерного участка между лидерным пептидом и первым сайтом гетероциклизации приводило к уменьшению скорости гетероциклизации. С другой стороны, добавление 11-ого глицина привело к увеличению скорости гетероциклизации в два раза [ 136 ].
