Опыты по расщеплению ДНК ДНК-гиразой in vitro
100 nM гираза инкубировалась с 7 nM релаксированной плазмидой pBR322 90 минут при 37*С в следующем реакционном буфере: 35 мМ Tris-Cl pH 7.5, 24 мМ KCl, 4 мМ MgCl2, 2 мМ DTT, 1.8 мМ спермидин, 1 мМ ATP, 6.5% (м/о) глицерин, 0.1 мг/мл БСА. Микроцин "Х" и микроцин "N" добавлялись как растворы в DMSO. Финальная концентрация DMSO не превышала 3%. Равные объемы DMSO добавлялись в контрольные реакции. Реакции останавливались добавлением 0.2% SDS и 0.3 мг/мл протеиназы К и инкубировались при 37*С еще 30 мин. К реакциям добавлялся равный объем смеси фенол-хлороформ-изоамиловый спирт (25:24:1) и половина объема буфера для нанесения на гель (40% сахароза, 100 мМ Tris-Cl, 1 мМ ЭДТА, 2мг/мл брофенолового синего). Смесь вортексировалась и центрифугировалась 5 мин при 13400 об/мин. Водная фаза наносилась на 0.9% агарозный гель (ТAЕ, 40 мМ Tris-ацетат, 1 мМ ЭДТА). Электрофорез проводился в течение 3 часов при 5 V/см. Гель окрашивали в 10 микроМ растворе этидий бромида в течение часа и промывали дистиллированной водой.
