Приготовление химически компетентных клеток E. coli (метод Inoue ea)
Для приготовления химически компетентных клеток использовался модифицированный метод Inoue et al. [ 137 ]. Клетки штамма DH5альфа высевали на чашки с твердой агаризованной средой LB; на следующий день отбирали 10-12 крупных (2-3 мм в диаметре) одиночных колоний и инокулировали в 200 мл среды SOB. Клетки помещали на качалку и инкубировали при комнатной температуре до достижения оптической плотности 0.8. После этого клетки переносили в лед на 10 мин и далее центрифугировали в течение 15 минут при 4*C, 3000 об/мин. Супернатант декантировали, осадок ресуспендировали в 80 мл холодного ТB буфера (250 мM KCl, 15 мM CaCl2, 55 мМ MnCl2, 10 мM PIPES pH 6.7). Инкубировали на льду 10 мин. Затем центрифугировали еще раз при тех же условиях. Осадки ресуспендировали в 20 мл буфера TB и, медленно помешивая, добавляли DMSO до 7%, после чего инкубировали на льду 10 мин. Далее клетки разделяли на аликвоты по 200 и 400 мкл и замораживали в жидком азоте, после чего хранили на -70*С. Для получения компетентных клеток, несущих плазмиду pACYC-mcbBCDEFG , культуру клеток DH5альфа, несущих данную плазмиду, выращивали на среде SOB с хлорамфениколом.
