Сайт-специфический мутагенез
Для внесения мутаций замены кодона в плазмиде pUC-mcbA , подбирались праймеры длиной 25-30 п.о., несущие в центре измененный кодон. Проводился ПЦР всей плазмиды с помощью ДНК-полимеразы PfuTurbo (Stratagene, США). В случае слишком высокой температуры отжига праймеров (>68*C) в ПЦР-смесь добавлялся 1% DMSO. Оптимальные условия реакции подбирались согласно руководству Stratagene. Для очистки от матрицы полученный ПЦР-продукт обрабатывался рестриктазой Dpn I, селективно расщепляющей метилированную и геми-метилированную ДНК, и затем дополнительно очищался с помощью электрофореза в агарозном геле. Выделенной из геля ДНК трансформировались химически компетентные клетки E. coli DH5альфа. Правильность мутаций подтверждалась секвенированием.
Для создания делеций использовался метод ПЦР всей плазмиды с праймерами, фланкирующими делетируюмую последовательность и направленными в разные стороны. Продукты реакции очищались путем электрофореза в агарозном геле, фосфорилировались с помощью Т4 киназы (NEB, США) и лигировались Т4 лигазой (NEB). Лигированными плазмидами трансформировались химически компетентные клетки E. coli DH5альфа. Правильность мутаций подтверждалась секвенированием.
