AlkA: пространственная структура
Структура Eco-AlkA в свободном состоянии обнаруживает сходство с 6HB- доменом Nth и содержит мотивы HhH и GPD [ Labahn, ea 1996 ]. AlkA также содержит a/b-домен с неизвестной функцией, обнаруживающий структурное сходство с TATA-связывающим белком TBP и состоящий из антипараллельного 5-складочного b-слоя и 2 a-спиралей. Домен, соответствующий FeS-домену Nth, сильно редуцирован и лишен FeS-кластера. Для получения структуры AlkA в комплексе с ДНК был использован высокоаффинный лиганд - ОДН, содержащий аналог переходного состояния, звено azaAP [ Hollis, ea 2000 ]. Как и в случаях Ung/UNG и OGG1, белок связывается в малой бороздке и образует основные контакты с поврежденной цепью ДНК. ДНК сильно изломана, azaAP вывернут из спирали ДНК в активный центр фермента, а остаток Leu125 заполняет межцепочечную полость. Мотив HhH, как и в случае OGG1, взаимодействует с ДНК с 3'-стороны от поврежденного звена (фосфатные группы p-1, p-2 и p-3), но, в отличие от OGG1, это взаимодействие частично опосредовано ионом Na+, координированного фосфатной группой p-3 и атомами O пептидных групп остатков Gln210, Phe212 и Ile215. Аналогичное опосредованное моновалентными катионами взаимодействие мотива HhH и ДНК обнаружено в структуре POL-b [ Pelletier, ea 1996 ]. Таким образом, мотив HhH в ДНК-гликозилазах, помимо непосредственного участия в катализе, важен для позиционирования фермента на ДНК. Поскольку поврежденное основание в структуре комплекса AlkA/azaAP-ДНК отсутствует, природа специфичности AlkA по отношению к широкому спектру алкилированных и дезаминированных оснований остается неясной. Связывающий поврежденные основания карман в составе Eco-AlkA выстлан ароматическими остатками Phe18, Trp218, Tyr222, Trp272 и Trp273 и достаточно велик (~10A в глубину и ~20A в ширину) для связывания оснований разного размера. Многие из субстратов AlkA характеризуются наличием положительного заряда, распределенного по азотистому основанию, и могут взаимодействовать с активным центром фермента не посредством образования специфических водородных связей, а за счет более прочного взаимодействия ароматических остатков фермента с электрондефицитной пи- системой выщепляемого основания, либо с обширной пи-системой eAde. К тому же положительный заряд на основании ослабляет N-гликозидную связь, и, возможно, стабилизации карбокатиона на дезоксирибозном цикле достаточно для работы фермента AlkA, отличающегося меньшей каталитической силой по сравнению с другими ДНК-гликозилазами [ Stivers, ea 2003 , O'Brien, ea 2004 ]. Эта стабилизация, по всей вероятности, предоставляется абсолютно консервативным остатком Asp238 в GPD-петле, расположенным у входа в активный центр.
