DenV: пространственная структура
Структура белка DenV в некоторых аспектах подобна структуре ДНК- гликозилаз суперсемейства Nth: в ней присутствует ДНК-связывающий мотив, который отдаленно напоминает HhH-мотив и состоит из спирали, шпильки и длинного участка без определенной вторичной структуры. По этой причине DenV иногда рассматривается как самый периферический член суперсемейства Nth [ Huffman, ea 2005 ].
Структура DenV определена методом РСА для белка дикого типа и каталитически неактивных мутантных форм (R3Q, E23Q, E23D) в свободном состоянии [ Morikawa, ea 1992 , Morikawa, ea 1995 ] и для мутантной формы DenV-E23Q в комплексе с ДНК, содержащей цис-син-циклобутановый тиминовый димер [ Vassylyev, ea 1995 ]. DenV представляет собой однодоменный a-спиральный белок, одна из сторон которого слегка вогнута и используется для связывания ДНК, а одна из a- спиралей (aA) изломана. Указанные замены практически не вносят изменений в структуру белка, если не считать сдвига нескольких структурных молекул воды; по всей вероятности, важность соответствующих аминокислотных остатков (Arg2 и Glu22) связана с их конкретными физико-химическими характеристиками и расположением в активном центре, а не с ролью в поддержании общей структуры белка.
В отличие от всех других ДНК-гликозилаз, структуры которых определены в комплексе с ДНК, содержащими поврежденное основание, DenV выворачивает из двуцепочечной ДНК не ЦПД-звено, остающееся в стэкинг- взаимодействии с окружающими основаниями, а остаток dAdo, находящийся напротив 5'-Thd-звена димера. Это открывает путь для внедрения остатков активного центра фермента в ДНК и их доступ к атому C1' субстратного дезоксинуклеотида. Интересно, что DenV вообще не образует контактов с основаниями, входящими в состав ЦПД, а выворачиваемый остаток dAdo образует только неспецифические ван-дер-ваальсовы или гидрофобные связи с неглубоким карманом в белковой глобуле. Замена основания напротив разных узнаваемых ферментом поврежденных звеньев ДНК с Ade на флуоресцентный 2-аминопурин (2-NH2-Pu) показывает, что природа поврежденного звена и пуринового основания напротив него не влияет на выворачивание [ McCullough, ea 1997 ]. Как и в случае других гликозилаз, ДНК в комплексе сильно изломана в районе поврежденного звена. Конформация связанного в малой бороздке полипептида DenV практически не отличается от его конформации в свободном состоянии. Комплекс фермент/ДНК стабилизирован множеством связей с сахарофосфатным остовом, в особенности в области ЦПД, где остов сильно сжат. Следует отметить, что каталитическая аминогруппа Thr1 в структуре DenV/ДНК располагается в 3,9A от атома C1' расщепляемой N-гликозидной связи и под углом, невыгодным для нуклеофильной атаки, что свидетельствует о необходимости определенных конформационных изменений перед разрывом связи. Предполагается, что важная для катализа карбоксильная группа Glu22 отдает протон либо атому O2 выщепляемого основания Thy, либо атому O4' соответствующего остатка dR [ Doi, ea 1992 , Manuel, ea 1995 ]. Роль важных для катализа остатков Arg2, Arg21 и Arg25 [ Doi, ea 1992 ] которые внедряются в межцепочечную полость ДНК, на сегодня неясна; на основании компьютерного моделирования предполагается, что положительный заряд Arg22 и Arg26 может электростатически стабилизировать анионную форму уходящего основания [ Fuxreiter, ea 1999 ].
Исходя из структуры комплекса DenV/ДНК, можно сказать, что непосредственные контакты с ЦПД не играют роли в узнавании поврежденной ДНК этим ферментом, и что оно, по всей вероятности, осуществляется по механизму непрямого считывания, основанного на структуре и энергии деформации ДНК в области повреждения. Например, деформация ДНК, вызванная присутствием в ней ЦПД [ Park, ea 2002 ], может облегчать ее изламывание и выворачивание комплементарного dAdo при связывании фермента по сравнению с нормальной ДНК.
.gif)