SMUG1: пространственная структура
В определенной методом РСА структуре SMUG1 из X.laevis в комплексе с ДНК [ Wibley, ea 2003 ] фермент находится в необычном положении после диссоциации из комплекса с продуктом и повторного связывания с концами двуцепочечного ОДН. Такая же картина наблюдается при использовании двуцепочечного ОДН, содержащего нерасщепляемый аналог субстратного звена 1-(2'-дезокси-2'-фтор-b-D-арабинофуранозил)урацил (bFU).
Расположенный на 5'-конце поврежденной цепи dCyd находится во внеспиральной конформации и направлен в сторону центра связывания поврежденного основания; замена 5'-концевого звена на bFU позволила исследовать структуру SMUG1 с поврежденным основанием, частично вставленным в активный центр, и построить модель взаимодействия фермента с ДНК. Два мотива - петля, интеркалирующая в малую бороздку (251PSPRN255, эквивалентная мотиву 5 в Ung/UNG) и короткая a-спираль (256PQANK260, уникальная для SMUG1) - вклиниваются в спираль ДНК и выворачивают выщепляемое основание через большую бороздку. Проникновение обоих пептидов внутрь двуцепочечной ДНК обеспечивает гораздо более выраженное изменение ее конформации, чем в случае ферментов Ung/UNG и Mug. Полость, оставшаяся в ДНК после выворачивания dUrd, заполняется консервативным остатком Arg254, а остаток Pro из уникальной a-спирали разрывает стэкинг оснований комплементарной цепи.
Другой конец двуцепочечного ОДН в структуре остается нерасплавленным, и активный центр связанной с ним молекулы SMUG1 открыт растворителю. Включение в кристаллизационный раствор свободных оснований Ura и hmUra позволило исследовать их взаимодействие с активным центром фермента. Атомы N3 и O4 в обоих случаях образуют водородные связи с боковой группой остатка Asn174, а атом O2 принимает водородные связи от атома N[Met95] и от имидазольной группы остатка His250. Такая конфигурация водородных связей означает, что дискриминация Cyt в активном центре SMUG1 проходит по той же схеме, что и у ферментов Ung/UNG. Однако механизм дискриминации Thy ферментом SMUG1 совершенно иной, чем у Ung/UNG. Остаток Tyr, характерный для Ung/UNG, заменен в SMUG1 остатком Gly98. В положении, соответствующем положению боковой цепи остатка Tyr в структуре Ung/UNG, находится хорошо структурированная молекула воды, которая при связывании Ura в активном центре образует ван-дер-ваальсов контакт с атомом C5 и водородную связь с атомом O4. Обе неподеленные электронные пары атома кислорода молекулы воды при этом принимают водородные связи от амидных групп пептидных связей остатков Gly98 и Met102, так что она может только подавать водородную связь на атом O4, что служит дополнительной мерой для дискриминации основания Cyt. Связывание Thy в активном центре может осуществляться только при вытеснении этой молекулы воды с разрывом всех образуемых ей связей. Однако при связывании основания hmUra те же водородные связи образуются за счет гидроксильной группы при экзоциклическом атоме углерода, что компенсирует эффект вытеснения структурированной молекулы воды.
