PS-гены: участие в протеолитическом расщеплении APP
Сразу после открытия трех генов болезни Альцгеймера (БА), было показано, что в плазме крови больных с мутациями как в APP, так и в пресенилинах, увеличено содержание амилоидогенного Aбета (Aбета42/43), основного компонента сенильных бляшек . В среде культуры клеток фибробластов, выделенной из этих больных, также детектировали повышенный уровень Aбета42/43 ( Scheuner, 1996 ).( Белок предшественник Aбета - APP представляет собой трансмембранный белок типа 1) .
В клетке APP подвергается протеолизу различными протеазами: альфа-, бета- и гамма-секретазами. Обнаружено три основных пути протеолиза APP:
1) альфа-расщепление и следующее за ним гамма-
2) бета-расщепление , за которым следует гамма- и
3) расщеплением в альфа/бета- и эпсилон-сайтах ( рис. 3 ). По одной из предложенных моделей цитоплазматический домен APP может связываться с адаптерными белками , такими как Fе65, причем такое связывание изменяет конформацию молекулы Fе65. Новая, "открытая" конформация стабилизируется неизвестными белковыми факторами. После протеолитического расщепления APP происходит освобождение активного "открытого" Fе65 в комплексе с AICD в цитоплазму.
Далее AICD может деградировать или сопровождает Fе65 в ядро. Ядерный Fе65 входит в состав нового комплекса, включающего гистон ацетилтрансферазу Tip60 , регулирующего транскрипцию генов ( Cao, 2001 , Cao, 2004 ). Найден ряд эффекторных генов, таких как сам APP , BACE , Tip60 , GSK3бета (гликоген синтаз киназа 3бета), KAI1 (супрессор опухолевого метастазирования) , активирующихся в результате описанного сигнального пути ( von Rotz, 2004 ).
Кроме Fе65 исследованы и другие адаптерные белки, связывающиеся с цитоплазматическим доменом APP: Jip1b , направляющий комплекс в ядро и X11 , удерживающий AICD в цитоплазме ( von Rotz, 2004 ).
Помимо описанных сайтов протеолиза альфа-, бета-, гамма - и эпсилон-, обнаружены также дельта- и дзета- ( рис. 3 ), кроме того, найден целый ряд минорных продуктов расщепления APP, имеющих сайты протеолиза вблизи основных ( Simons, 1996 ; Wang, 1996 ; Zhao, 2004 ).
Для изучения того, каким образом пресенилины участвуют в процессинге APP были созданы клеточные линии и трансгенные мыши, ко-экспрессирующие APP и нормальные или мутантные формы генов пресенилинов. Экспрессия мутантных пресенилинов, в отличие от пресенилинов "дикого типа", приводила к значительному повышению уровня амилоидогенного Aбета42/43 в культуральной среде линий клеток и в мозге трансгенных мышей ( Borchelt, 1996 ; Citron, 1997 ; Duff, 1996 ; Oyama, 1998 ; Nakano, 1999 ; Qian et al., 1998 ).
В исследованиях De Strooper и др. были использованы нейрональные культуры клеток мышей, с нокаутированным геном пресенилина 1. В PS1 -/- клетках происходило ингибирование секреции P3 и Aбета и накопление С-концевых продуктов альфа- и бета- протеолиза эндо- или экзогенного APP (APPs-альфа и APPs-бета). Таким образом, было показано, что гамма-расщепление APP напрямую зависит от пресенилина 1. В бластоцистах мышей, двойных нокаутах по PS (PS1-/-, PS2-/-), полностью отсутствовал протеолиз APP в гамма-сайте ( Zhang, 2000 ).
Ген PS1 с мутациями в сайтах консервативных аспартатов трансмембранных доменов VI и VII (D257A, D385A) ингибировал протеолиз APP при экспрессии в клеточных культурах ( Wolfe, 1999a ). Экспрессия PS1 D257A в двойных нокаутах по PS, не восстанавливала протеолиз APP ( Xia, 2002 ). Важная роль аспартатов, а также С- терминального пролина белков PS1, PS2 в гамма-протеолизе APP на модели клеточных культур подтверждена также в ряде других работ ( Steiner, 1999 ; Levitan, 2001 ; Tomita, 2001 ; Wang, 2004 ). Показано также, что все сайты расщепления, находящиеся внутри трансмембранного домена APP (гамма-, эпсилон-, дзета-) зависят от активности пресенилинов ( рис. 3 ). В экспериментах по коиимунопреципитации найдено, что APP может образовывать комплексы с пресенилинами ( Xia, 1997 ).
Мутации в PS, вызывающие потерю протеолитической функции белка (loss-of-function) называют еще доминантно-негативными, в отличие от мутаций, вызывающих изменение функции PS (gain-of-function), включающие все мутации болезни Альцгеймера (БА). Известные на сегодняшний день мутации БА локализованы в кодирующей области генов пресенилинов и приводят к аминокислотным заменам преимущественно в трансмембранных, гидрофобных доменах белка. При экспрессии PS1 и PS2 c мутациями БА в различных клеточных культурах и в трансгенных мышах происходит смещение соотношения продуктов бета-/гамма- протеолитического пути секретируемого Aбета42(43)/40 в сторону амилоидогенного Aбета42(43). В норме соотношение Aбетк42(43)/40 составляет примерно 1:9 ( Sisodia, 2002 ), при БА оно увеличивается в несколько раз. На трансгенных линиях мышей, экспрессирующих мутантные формы PS1, было показано, что накопление амилоида в мозге зависело от количества секретируемого Aбета42, которое отличалось для различных мутаций. БА мутации влияли на усиление протеолиза с образованием Aбета42, при этом секреция Aбета40 оставалась на прежнем уровне. Таким образом, действие мутаций при БА возможно не сводится к простому изменению сайта сродства гамма-протеазы, а представляет более комплексный процесс ( Jankowsky, 2004 ).
