GSPT как PABP-связывающий белок
Существование уникального N-концевого участка GSPT/eRF3 , не вовлеченного в связывание с eRF1, позволило предположить для этого белкового семейства дополнительные функции. Для выявления белков, взаимодействующих с белками семейства GSPT, мы провели скрининг клонотеки кДНК клеток лимфомы человека с использованием дрожжевой двугибридной системы [ Hoshino, ea 1999 ]. Скрининг выявил полиаденилатсвязывающий белок РАВРI , способный взаимодействовать с N-концевым участком GSPT/eRF3. Как показано на рис. 1Б , белок РАВРI содержит на N-конце четыре РНК-связывающих домена в форме тандемного повтора; эти домены связываются с З'-поли (А) последовательностью мРНК, возможно, способствуя ее стабилизации и/или транслокации из ядра в цитоплазму (см. обзоры [ Gallic, ea 1998 , Sachs, ea 1997 ]).
Предполагали, что С-концевой участок РАВР способствует поддержанию правильной регулярной структуры РНК-связывающего белка на поли (А) последовательности [ Sachs, ea 1987 ]. Дальнейшие исследования с использованием GSPT и РАВР разной длины в двугибридной системе показали, что во взаимодействии этих белков участвует N-концевой фрагмент GSPT и С-концевой фрагмент РАВР. Функциональную роль этого взаимодействия анализировали в опытах по связыванию in vitro с оценкой изменения подвижности в геле. Как видно из рис. 3 , 3'-, 5'-[32Р]меченная синтетическая поли(А) РНК связывается с РАВР, образуя продукт пониженной подвижности. Подвижность комплекса уменьшалась с увеличением количества РНК-связывающего белка, что показывает возможность связывания с молекулой меченой поли (А) РНК нескольких молекул РАВР ( рис. 3а ). Однако в присутствии N-концевого фрагмента GSPT ( рис. 3б ) наблюдалось резкое изменение подвижности, а не постепенный переход, что указывает на формирование только одного комплекса при насыщающей концентрации РАВР в присутствии GSPT; подвижность этого комплекса ниже, чем в случае связывания одной молекулы РАВР с поли (А), поскольку в состав комплекса входит N-концевой участок GSPT. Эти результаты показывают, что если С-концевой фрагмент РАВР связан с GSPT, то РАВР утрачивает способность взаимодействовать с другими молекулами РАВР, т.е. утрачивает способность образовывать множественный комплекс регулярной структуры на поли (А). Это не противоречит полученным ранее данным об аналогичных свойствах РАВР, лишенного С-концевой части [ Kuhn, ea 1996 ].
