IL-2: исследования с помощью направленного мутагенеза
Одним из наиболее информативных методов, применяемых в настоящее время для структурно-функционального анализа белка, является метод сайт-направленного мутагенеза . Особенно этот метод эффективен в комбинации с другими подходами.
Данные о мутантных белках, показавших изменение биологической активности относительно дикого типа rIL-2 , суммированы в табл. 2 . Из-за различий в концентрациях белков, методах их выделения и очистки, а также из-за разнообразия клеточных линий, используемых для тестирования, невозможно дать сравнительную количественную оценку биологической активности мутантных белков, поэтому в таблице указана лишь общая тенденция (уменьшение или увеличение биологической активности).
Суммируя приведенные в табл.2 данные, в молекуле IL-2 человека можно выделить три функционально-значимые области: аминокислоты 1-20 (I), 30-60 (II) и 116-132 (III). Хотя границы этих областей нуждаются в уточнении, следует отметить, что большинство аминокислотных остатков области I входит в состав спирали А, область II относится к спиралям B и B', а область III - к С-концевой спирали F. С большой степенью вероятности можно утверждать, что эти спирали участвуют в образовании активного центра молекулы.
Для функционирования IL-2 необходимы также остатки Cys-58 и Cys-105, связанные, согласно данным масс-спектрометрии, дисульфидной связью [ Fukuhara K., ea, 1985 ]. Любая мутация этих остатков приводит к катастрофическому падению биологической активности IL-2 [ Cohen F.E., ea, 1986 , Ju, ea, 1986 , Wang A., ea, 1984 ].
При проверке мутантных белков в тестах на связывание с IL-2R были идентифицированы некоторые аминокислоты, взаимодействующие с рецептором. Для связывания субъединицы IL-2R (p75) требуются аминокислоты 11-19, образующие спираль А, и расположенная рядом с этой спиралью аминокислота Asn-20 [ Weigel U., ea, 1989 , Ju,G., L.Collins , ea, 1987 , Collins L., W.H.Tsien, ea, 1988 ]. С субъединицей IL-2R (p55) взаимодействуют аминокислоты Lys-35, Arg-38, Phe-42, Lys-43, относящиеся к спирали В [ Weigel U., ea, 1989 , Sauve K., ea, 1991 ], и аминокислотные оcтатки спирали F [ Zurawski S.M., ea, 1989 ]. В связывании рецептора, возможно, также участвуют спираль Е (аминокислоты 107-117) и аминокислоты Gln-119, Ser-127 и 131-133 [ Landgraf B.E., 1991 , Collins L., W.H.Tsien, ea, 1988 ]. На основании этих данных, а также результатов рентгеноструктурного анализа молекулы IL-2, была предложена модель связывания IL-2 с IL-2R [ Waldmann T.A., ea, 1991 ].
Сходные результаты были получены при изучении структуры IL-2 мыши [ Zurawski S.M., ea, 1988 ]. Анализ 130 делеционных мутантов показал, что внутри молекулы мышиного IL-2 существует три области, существенные для поддержания пролиферации IL-2-зависимой мышиной Т-клеточной линии. Эти области (аминокислоты 32-35, 66-77, 119-141, что соответствует аминокислотам 18-21, 52-63 и 104-126 IL-2 человека) составляют 26% белка и являются критическими для его биологической активности. Районы 32- 35 и 119-141 являются наиболее вероятными участками связывания IL- 2R. Возможно, что с рецептором также взаимодействует область 66-77, связанная с областью 119-141 дисульфидной связью.
В подавляющем большинстве исследований биологическая активность IL-2 оценивалась с помощью IL-2-зависимых цитотоксических Т-клеточных линий . В работе [ Ju,G., L.Collins , ea, 1987 ] было показано, что биологическая активность мутантных белков, определенная по способности индуцировать секрецию гамма-INF или активировать NK-клетки , хорошо коррелирует со способностью поддерживать пролиферацию Т-лимфоцитов. Вероятно, для выполнения этих функций требуются сходные (идентичные) конформации молекулы IL-2.
Один из главных недостатков метода сайт-направленного мутагенеза заключается в том, что для тестирования биологической активности часто используются грубые бактериальные экстракты, которые могут содержащать белок в неактивной, денатурированной форме. Более надежные результаты с помощью этого метода можно получить, тестируя ренатурированные, очищенные мутантные белки.
