Ген 6-16: факторы, взаимодействующие с областью IRSE
Двухцепочечный олигонуклеотид размером 39 н.п. соответствующий 5'-концу гена 6-16 и содержащий IRSE , конкурирует за связывание с факторами, необходимыми для экспрессии гена a-IFN в трансфецированных клетках ( Dale et al., 1989 ). Замена только одного основания (А-11 на С) внутри ISRE GGGAAAATGAAACT) снимает эту конкуренцию.
Исследования по торможению в геле, проведенные с олигонуклеотидом (39 н.п.) и экстрактом из целых клеток, позволяют обнаружить специфические комплексы. Они формируются быстроиндуцируемыми основными белковыми факторами .
Оба вида факторов не связываются с "мутантным" олигонуклеотидом (GGGAAAATGAСACT). Анализ показал, что эти белки имеют взаимоперекрывающиеся сайты связывания.
Dale et al. (1989 ) обнаружили три различных фактора, которые появляются через разные промежутки времени после обработки клеток интерфероном . В большинстве клеток спустя несколько минут после индукции появляется комплекс Е . Его количество уменьшается при более длительном времени обработки интерфероном. В клетках HeLa дополнительные комплексы (М и L ) обнаруживаются после 2-8 часов. Подобные индуцированные комплексы наблюдали при работе с экстрактами клеток WI-38 и человеческих фибробластов . Появление комплекса Е не нуждается в белковом синтезе, в то время как образование М и L комплексов не происходит при добавлении ингибитора синтеза белка.
В своих опытах Dale et al. (1989 ) использовали клетки Bristol 8B , которые имеют легко наблюдаемый уровень Е и основные комплексы С1/С2 . В некоторых экспериментах после двух часов наблюдается небольшая индукция С2 a-интерфероном . Нормальный олигонуклеотид длиной в 39 н.п. в равной степени конкурирует за Е и за С1/С2.
14-нуклеотидный ISRE из 6-16 , GGGAAAATGAAACT, включает 5' участок необходимый для индукции транскрипции a-интерфероном ( Porter et al., 1988 ). Фактор-Е в экспериментах по конкуренции хуже присоединяется к нему. Оказалось, что ISRE- олигонуклеотид длиной 14 н.п. слишком короток, чтобы хорошо связывать Е-фактор. Дополнительные прилегающие последовательности улучшают связывание, что указывает на их взаимодействие с белком.
Белкам, образующим С1/С2 для оптимального связывания не нужны специфические последовательности рядом с 14-нуклеотидным ядром ISRE.
Эксперименты с мутантными олигонуклеотидами (14 н.п.) показали что остатки G-2 и G-3 важны для формирования Е, но не для С1/С2. Результаты указывают на то, что G-2 и G-3 находятся в одном и том же домене связывания комплекса Е. Когда домен был прерван единичными или несколькими заменами, связывание фактора Е полностью утрачивалось.
Авторы предполагают, что в образовании Е участвуют и другие независимые домены внутри элемента (39 н.п.). Возможно, это последовательность GGGAGA, которая частично защищена в DMS Interference опыте. Она отличается от 6bp мотива ISRE только одной заменой А на G и расположена на расстоянии 9bp слева от GGGAAAATGAAACT.
