Вирусные инфекции: лабораторная диагностика, общие сведения
Несмотря на разнообразие современных методов лабораторной диагностики вирусных инфекций, основными из них по-прежнему остаются серологические исследования и выделение вируса в культуре клеток. Диагностическим критерием острой вирусной инфекции обычно служат более чем четырехкратное увеличение титра антител к вирусным антигенам и изменение класса специфических иммуноглобулинов с IgM на IgG в парных сыворотках, взятых в острой стадии заболевания и во время выздоровления. Для выявления антител к определенному вирусу чаще всего используют реакции гемадсорбции, гемагглютинации или метод непрямой иммунофлюоресценции. Последний основан на взаимодействии сывороточных антител с вирусными антигенами в зараженных вирусами фиксированных клетках. В реакциях гемадсорбции и гемагглютинации используется способность сывороточных антител к гемагглютининам РНК-содержащих вирусов угнетать вызываемую вирусом адсорбцию или агглютинацию эритроцитов.
Широкое применение находит ИФА (ELISA), основанный на использовании специфических вирусных белков, выделенных из зараженных клеток или полученных методом генной инженерии. Вирусные антигены сорбируют на стенках пластиковых ячеек и инкубируют с исследуемой сывороткой. После отмывания несвязавшихся белков в ячейки добавляют так называемые вторые антитела - ковалентно связанные с ферментом (обычно пероксидазой или ЩФ) антитела к IgM или IgG человека. Избыток вторых антител отмывают, а количество связавшихся, зависящее от количества противовирусных антител в сыворотке, оценивают по интенсивности ферментативной цветной реакции. ИФА поддается автоматизации. Это более чувствительный и менее трудоемкий метод, чем иммунофлюоресценция, гемагглютинация и гемадсорбция.
Иммуноблоттинг позволяет одновременно выявлять антитела к нескольким вирусным антигенам. Для этого смесь антигенов, разделенных с помощью электрофореза и перенесенных на адсорбирующую мембрану, инкубируют с сывороточными антителами. С помощью этого метода также можно оценить степень специфичности антител сыворотки, сравнив интенсивность реакции с вирусными и клеточными антителами. Иммуноблоттинг - высокочувствительный и высокоспецифичный метод, но он не подходит для массовых исследований и его результаты трудно оценить количественно.
Другой метод диагностики основан на выделении вирусов в культуре клеток. Размножаясь в культуре клеток, вирусы нередко оказывают цитопатическое действие, видимое под световым микроскопом. Например, размножение вируса простого герпеса в культуре клеток почек кролика вызывает характерное цитопатическое действие в течение трех дней. В других случаях цитопатическое действие вирусов позволяет поставить лишь предварительный диагноз, который подтверждают путем иммунофлюоресцентного окрашивания с использованием моноклональных антител к данному вирусу. Вирусы, выделенные в культуре клеток, идентифицируют также с помощью реакции гемадсорбции, методом интерференции (например, клетки, зараженные вирусом краснухи , приобретают устойчивость к цитолитическому действию ЕСНО-вирусов ) или с помощью электронной микроскопии (при условии, что при световой микроскопии видны изменения клеточной морфологии).
Эффективность и скорость идентификации вирусов увеличиваются при сочетании кратковременного культивирования с иммунологическими методами. Для обнаружения вируса в однослойной культуре клеток, растущей на покровном стекле, можно использовать моноклональные антитела к специфическому раннему вирусному белку. Таким образом, зараженные клетки удается выявить в течение нескольких часов или суток после заражения - то есть до того, как вирус пройдет несколько циклов репродукции, необходимых для появления видимого цитопатического действия.
Для эффективного выделения вируса в культуре важно правильно собрать материал и быстро перенести его в лабораторию в подходящей среде. Это обеспечивает сохранение жизнеспособности вирусов и ограничивает размножение бактерий и грибов. Вирусы, покрытые липидсодержащей внешней оболочкой, гораздо более чувствительны к замораживанию и оттаиванию по сравнению с вирусами, состоящими только из нуклеокапсида. Способ взятия материала определяется патогенезом инфекции. Вирусы, вызывающие респираторные заболевания , легче всего выделить из содержимого носоглотки, трахеи или бронхов; мокрота для этих целей малопригодна из-за вязкости и загрязнения бактериями, что может вызвать гибель клеточной культуры. Вирус простого герпеса и вирус varicella-zoster обычно выделяют из везикулярной жидкости. Содержимое носоглотки и кал используют в тех случаях, когда лихорадка и сыпь позволяют заподозрить энтеровирусную инфекцию . При геморрагическом цистите аденовирусы выделяют из мочи. Цитомегаловирусы выделяют из мочи или лейкоконцентрата. Если вирус поражает внутренние органы (например, при энцефалите, вызванном герпесвирусами , или аденовирусной пневмонии ), для его выделения используют биопсийный материал.
В отличие от серологических реакций, культивирование не позволяет установить время возникновения первичной инфекции. Многие вирусы постоянно или временно заселяют слизистые у здоровых людей. Так, герпесвирусы нередко выделяют из слюны, а в 1 % образцов мочи, взятых у здоровых людей, обнаруживают цитомегаловирусы . Наибольшее диагностическое значение имеет выделение вирусов из крови, СМЖ и биопсийного материала.
Метод прямого определения вирусных антигенов предназначен для быстрой диагностики вирусных инфекций. Зараженные вирусом клетки, полученные непосредственно от больного, выявляют с помощью моноклональных антител к вирусным антигенам. Так выявляют, например, клетки эпителия носоглотки, зараженные вирусами - возбудителями ОРЗ . Диагностическая ценность пробы Цанка (микроскопическое исследование соскоба со дна везикулы с целью выявления гигантских многоядерных клеток при герпесе и опоясывающем лишае) значительно повышается при окраске мазков с помощью моноклональных антител к вирусу простого герпеса или вирусу varicella-zoster .
Моноклональные антитела применяют и для специфического окрашивания гистологических препаратов.
Развитие молекулярно-генетических методов открывает новые возможности в лабораторной диагностике вирусных инфекций. Эти методы позволяют обнаружить ничтожно малое количество вирусной нуклеиновой кислоты в исследуемом материале, отличаются чувствительностью, быстротой и не зависят от жизнеспособности выделенного вируса и его способности к репродукции. Например, при исследовании СМЖ больных герпетическим энцефалитом чувствительность метода, основанного на ПЦР, существенно выше, чем чувствительность выделения вируса в культуре. Однако крайне высокая чувствительность данного метода может привести к ложноположительным результатам из-за загрязнения пробы. Поэтому перед внедрением в клиническую практику молекулярно-генетические методы требуют стандартизации, а их клиническая пригодность должна систематически оцениваться.
Согласно проведенным исследованиям, определяемая с помощью ПЦР концентрация вирусной РНК в крови - хороший показатель развития ВИЧ-инфекции , а также появления устойчивых штаммов ВИЧ. Этот метод одобрен FDA. К недостаткам молекулярно-генетических методов относится их высокая стоимость.
