Ингибирование связывания ДНК в свободной сигма-субъединице
Сигма-субъединица РНК-полимеразы (РНКП) в свободном состоянии не взаимодействует с промоторами, хотя и принимает основное участие в их узнавании в составе холофермента РНКП. Сигма-субъединица также не способна узнавать индивидуальные промоторные элементы в составе коротких однонитевых или двунитевых олигонуклеотидов (в том числе, не способна узнавать -10 элемент в нематричных олигонуклеотидах) ( Dombroski, 1997 ).
Ранее было предложено несколько возможных механизмов ингибирования ДНК-связывающей активности в свободной сигма-субъединице.
- Во-первых, предполагалось, что взаимодействие сигма с ДНК ингибируется N-концевым районом сигма, в частности, отрицательно- заряженным районом 1.1 ( Dombroski et al., 1993 ). Возможно этот район может либо напрямую экранировать ДНК-связывающие сайты районов 2 и 4, либо действовать аллостерически ( Camarero et al., 2002 ; Dombroski et al., 1993 ; Schwartz et al., 2008 ).
- Во-вторых было показано, что в свободном состоянии сигма принимает компактную конформацию, в которой районы 2 и 4 сближены друг с другом, что также может приводить к экранированию ДНК-связывающих сайтов ( Callaci et al., 1999 ). Анализ структуры комплекса альтернативной сигма28-субъединицы E. coli с антисигма-фактором предполагает, что ДНК- связывающие домены сигма28 экранированы за счет их сближения друг с другом и не могут участвовать в узнавании промотора ( Sorenson et al., 2004 ). Однако, возможная роль данного механизма в ингибировании связывания ДНК в главных сигма-субъединицах остается неизвестной.
- В-третьих, возможно ингибирование связывания ДНК в свободной сигма-субъединице связано с локальными изменениями структуры ДНК- связывающих районов, в частности, района 2 ( Anthony and Burgess, 2002 ; Callaci et al., 1998 ).
При изучении механизма ингибирования связывания ДНК-связывающей активности в свободной сигма-субъединице были использованы аптамеры, содержащие промоторные элементы. В отличие от промоторов, аптамеры узнаются свободной сигма-субъединицей с высокой аффинностью и специфичностью. Следовательно, выяснив, какие структурные перестройки сигма-субъединицы требуются для узнавания промоторных элементов в составе аптамеров, можно понять, каким образом происходит ингибирование узнавания промоторных элементов в свободной сигма-субъединице. Полученные результаты исследования взаимодествия сигма-субъединиц с аптамерами ( Табл. 2.1 ) показали, что район 1.1 не влияет ни на узнавание -10 и TG-элементов районом 2 сигма-субъединицы, ни на узнавание GGGA- элемента районом 1.2.
Известно, что наиболее заметным конформационным изменением при связывании сигма-субъединицы с кор-ферментом является увеличение расстояния между доменами 2 и 4 сигма ( Callaci et al., 1999 ; Heyduk and Heyduk, 2002 ). Проведенные эксперименты и анализ изменений расстояний между этими доменами в сигма-субъединицах E. coli и T. aquaticus при связывании аптамеров установили: сближение доменов 2 и 4 в свободной сигма-субъединице не препятствует узнаванию промоторных элементов в составе аптамеров. Следовательно, сближение этих доменов в свободной сигма-субъединице само по себе не может объяснить ее неспособность к узнаванию промоторов.
В целом, полученные данные позволяют сделать вывод, что узнавание ДНК свободной сигма-субъединицей не требует серьезных структурных перестроек сигма-субъединицы. В частности, узнавание -10, TG и GGGA элементов промотора в составе атамеров не зависит от наличия района 1.1 сигма-субъединицы и может происходить в компактной конформации сигма, в которой районы 2 и 4 сближены друг с другом. Вероятно, для активации связывания ДНК необходимы локальные конформационные изменения, непосредственно затрагивающие ДНК-связывающие сайты сигма.
