Транскрипция: механизм инициации у бактерий, резюме
Общий механизм инициации транскрипции у бактерий выглядит следующим образом.
Первой стадией инициации является узнавание промоторов РНК- полимеразой (РНКП). Основную роль в узнавании промоторов играет фактор инициации - сигма-субъединица . Сигма содержит в своем составе функционально-активные участки, ответственные за узнавание -10, -35, TG- и GGGA-элементов промотора. ДНК-связывающая активность сигма активируется кор-ферментом РНКП при образовании холофермента . Структурные перестройки сигма включают как изменение расстояния между доменами (в том числе, сигма2 и сигма4), что необходимо для одновременного узнавания по-разному расположенных промоторных элементов, так и локальные конформационные изменения в ДНК-связывающих участках (в том числе, в районе 2). Наличие большого числа независимо узнаваемых промоторных элементов лежит в основе огромного разнообразия промоторов, различающихся по силе взаимодействий с РНКП и эффективности транскрипции. РНКП разных бактерий могут значительно различаться по специфичности узнавания промоторов, за счет различий в специфичности и эффективности узнавания разных типов промоторных элементов.
Кор-фермент РНКП вносит значительный вклад в узнавание промоторов. Во-первых, кор-фермент РНКП содержит участки специфического узнавания ДНК, которые могут взаимодействовать с промоторной ДНК. Кроме С-концевых доменов альфа-субъединиц, способных узнавать UP-элемент промотора, бета- и бета'-субъединицы РНКП тоже имеют участки специфического связывания ДНК, в том числе, в доменах flap, clamp, бета1 (которые удалось выявить с помощью аптамеров ). Данные участки, вероятно, могут участвовать в узнавании промоторов, а также регуляторных сигналов на стадиях элонгации и терминации транскрипции . Во-вторых, неспецифические контакты кор- фермента с промоторной ДНК также влияют на узнавания промоторов и способны определять межвидовые различия в эффективности инициации транскрипции на разных промоторах. Изучение механизмов и регуляторной роли специфических и неспецифических взаимодействий кор-фермента РНКП с промоторами в инициации транскрипции является важной задачей дальнейших исследований.
Второй стадией инициации является плавление ДНК и образование открытого промоторного комплекса . В плавлении ДНК решающую роль играют взаимодействия района 2 сигма-субъединицы с -10 элементом промотора. Кроме консервативных аминокислотных остатков, которые взаимодействуют с нуклеотидами -10 элемента, в плавлении большую роль играют неконсервативные остатки района 2 сигма-субъединицы, взаимодействующие с ДНК и с кор-ферментом РНКП. Различия неконсервативных остатков определяют различия в плавлении промоторов РНКП разных бактерий. В открытом промоторном комплексе ДНК оказывается расплавлена вокруг стартовой точки транскрипции, причем -10 элемент находится в однонитевом состоянии и взаимодействует с районом 2 сигма-субъединицы. Холофермент РНКП обладает высокой аффинностью к шпилечным структурам, содержащим -10 элемент в однонитевом участке, что, видимо, и является движущей силой плавления ДНК.
Стабильность промоторных комплексов обеспечивается специфическими контактами сигма-субъединицы с промоторными элементами: -10, TG, -35 и GGGA. Кроме того, в стабилизации промоторных комплексов важнейшую роль играют взаимодействия кор-фермента РНКП (а именно, домена clamp и района switch2 бета'-субъединицы) с ДНК спереди по ходу транскрипции. Различия в структуре данных взаимодействий, по-видимому, определяют различия в стабильности промоторных комплексов РНКП разных бактерий.
Третьей стадией инициации является собственно инициация синтеза РНК в активном центре РНКП. Сигма-субъединица РНКП играет главную роль в связывании инициаторных нуклеотидов и в образовании первой фосфодиэфирной связи в процессе инициации. Сигма-субъединица, по- видимому, аллостерически способствует формированию функциональной конформации активного центра фермента, за счет контактов с районом switch2 бета'-субъединицы и изменения положения матричной цепи ДНК.
Заключительным этапом инициации является уход РНКП с промотора. Переход к элонгации сопровождается значительными изменениями структуры транскрипционного комплекса . Одним из факторов, способствующих эффективному переходу к элонгации, является конкуренция растущего РНК- транскрипта с сигма-субъединицей РНКП.
Результатом этой конкуренции становится либо абортивная инициация, либо диссоциация сигма-субъединицы и разрыв контактов РНКП с промотором. Относительная эффективность данных процессов и эффективность перехода к элонгации определяются силой контактов РНКП с промотором, а также силой взаимодействий сигма-субъединицы с кор-ферментом РНКП. РНКП разных бактерий различаются эффективностью перехода к элонгации, что, вероятно, связано с различиями в силе РНКП-промоторных взаимодействий. РНКП исследованных мезофильных и термофильных бактерий проявляют значительные различия на разных стадиях инициации, в том числе, различия в узнавании и плавлении промоторов, в стабильности промоторных комплексов и эффективности перехода к элонгации, а также различия в скорости катализа. Большинство различий в транскрипционных свойствах РНКП на стадии инициации транскрипции не связано с различиями в температурной адаптации исследованных бактерий. В то же время, значительные различия в каталитической активности РНКП мезофилов и термофилов являются следствием температурной адаптации и объясняются различиями в структуре функционально-важных участков активного центра фермента.
Большая сложность и многостадийность механизма инициации обеспечивает широкие возможности для регуляции транскрипции с участием самых различных факторов транскрипции (как клеточных, так и кодируемых бактериофагами), низкомолекулярных соединений и метаболитов. Дальнейшие исследования транскрипции должны быть направлены на установление полной картины молекулярных событий, происходящих в процессе синтеза и РНК и изучение всего широкого разнообразия механизмов регуляции транскрипции. Наиболее важными из задач, которые предстоит решить в дальнейших исследованиях, являются следующие.
- Расшифровка точной структуры открытого промоторного комплекса, а также структуры промежуточных комплексов, формирующихся в процессе открывания промоторов.
- Установление разнообразия промоторных элементов и промоторов, узнаваемых РНКП разных бактерий.
- Исследование механизмов действия регуляторных факторов - клеточных белков, факторов бактериофагов и синтетических регуляторов, - влияющих на взаимодействия РНКП с промоторами и на инициацию транскрипции.
- Расшифровка механизмов специфического узнавания различных регуляторных сигналов, закодированных в ДНК и РНК, на стадиях элонгации и терминации транскрипции.
- Установление детальных механизмов конформационных изменений РНКП, происходящих в ходе катализа различных реакций.
- Выявление новых клеточных факторов - белков, малых молекул, некодирующих РНК, - регулирующих каталитическую активность РНКП, и исследование механизмов их действия.
- Создание новых ингибиторов РНКП, действие которых основано на подавлении разных стадий инициации транскрипции: связывания и плавления ДНК, инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора.
Можно надеяться, что прогресс в структурных исследованиях РНКП, сопряженный с биохимическим и генетическим анализом транскрипции, будет способствовать быстрому и эффективному решению поставленных задач в самое ближайшее время. Проведение этих исследований не только поможет понять один из наиболее фундаментальных генетических процессов, но будет иметь и важнейшее практическое значение, в том числе, для создания искусственных тонко-регулируемых систем генной экспрессии, получения новых лекарств и антибиотиков.
