Присоединение NTP в активном центре бактериальной РНК-полимеразы
Кроме G-петли , в связывании входящего NTP важную роль играют другие участки активного центра. Связывание нуклеотида в инсерционном сайте зависит от наличия комплементарных взаимодействий с матричным нуклеотидом ДНК. Правильная ориентация матричного нуклеотида в инсерционном сайте, необходимая для взаимодействия с входящим NTP, обеспечивается F-cпиралью , консервативный остаток Thr которой (Т1088 в РНКП T. thermophilus , T831 в РНКП II S.cerevisiae) контактирует с азотистым основанием матричного нуклеотида ( Рис. 4.5 А, Б). В связывании трифосфатной части NTP участвуют каталитические ионы магния, а также пять консервативных остатков аргинина бета'- и бета-субъединицы ( Рис. 4.5 Б). Рибозная часть нуклеотида контактирует с остатками R704 и N737 бета'-субъединицы (нумерация T. thermophilus). Первый из них образует водородные связи с 2'-ОН группой входящего NTP, а также с 2'-ОН группой 3'концевого нуклеотида РНК, а второй - с 2'-ОН и 3'-ОН группами входящего NTP ( Рис. 4.5 В). Это позволяет предположить, что данные остатки могу играть роль в дискриминации рибо- и дезоксирибонуклеотидов. Действительно, было показано, что замены остатка N458 в РНКП E. coli (соответствует N737 у T. thermophilus) и остатка R446 в РНКП II S. cerevisiae (соответствует R704 у T. thermophilus) нарушают дискриминацию субстратов ( Kaplan et al., 2008 ; Svetlov et al., 2004 ). Эффект этих мутаций заключается в значительном снижении скорости включения рибонуклеотидов, в то время как скорость включения дезоксирибонуклеотидов, которая в норме на несколько порядков ниже, чем скорость включения рибонуклеотидов, снижается в гораздо меньшей степени. Вероятно, взаимодействия аминокислотных остатков РНКП с 2'-ОН группой рибозы способствуют правильному связыванию субстрата, и таким образом увеличивают скорость реакции.
В структуре элонгационного комплекса (ЭК) бактериальной РНКП видны оба каталитических иона магния, принимающих участие в катализе ( Рис. 4.5 ) ( Vassylyev et al., 2007b ). В соответствии с многочисленными биохимическими и структурными данными ( Рис. 4.2 ), первый ион магния (MgI) координирован тремя аспартатами мотива NADFDGD (D797, D741 и D743 у T. thermophilus) бета'-субъединицы и 3'-гидроксильными группами 3'- концевого нуклеотида РНК и входящего нуклеотида ( Рис. 4.5 Г). Второй ион магния (MgII) в инсерционном комплексе РНКП T. thermophilus координирован только одним из каталитических аспартатов (D739), а остальные координационные связи занимают кислороды трифосфатной группы и две молекулы воды, которые связаны в активном центре и, по-видимому, принимают участие в реакции ( Рис. 4.5 Г) ( Vassylyev et al., 2007b ). В связывании предполагаемых каталитических молекул воды участвуют абсолютно консервативные остатки глутаминовой и аспарагиновой кислоты в 685 и 686 положениях бета-субъединицы (соответствуют остаткам E813 и D814 в РНКП E. coli) ( Рис. 4.5 Г). Как было показано, замены данных остатков серьезно нарушают каталитическую активность РНКП ( Sosunov et al., 2003 ).
Сравнение структур ЭК РНКП T. thermophilus с нуклеотидом в преинсерционном и инсерционном сайтах, а также доступных на сегодняшний день структур ЭК РНКП II S. cerevisiae (в отсутствие и в присутствии субстратов, а также в комплексе с альфа-аманитином ) показывает, что G-петля может принимать несколько функционально-значимых конформаций на разных стадиях каталитического цикла ( Рис. 4.6 ). В отсутствие субстрата G-петля, по-видимому, находится в открытом состоянии и может принимать различные положения; этим объясняется то, что участок G-петли оказывается неразрешенным в структуре ЭК РНКП T. thermophilus в отсутствие входящего нуклеотида ( Vassylyev et al., 2007a ). Структуру G- петли в открытом состоянии удалось разрешить в случае ЭК РНКП II: петля отведена в сторону от активного центра и не контактирует с F-спиралью РНКП ( Рис. 4.6 В и Г) ( Kettenberger et al., 2004 ). Связывание нуклеотида в преинсерционном сайте индуцирует сворачивание нижней части неструктурированной G-петли в спирали, однако, сворачивание оказывается неполным и центральная часть G-петли остается удалена от активного центра ( Рис. 4.6 А).
Точную структуру ЭК в преинсерционном состоянии удалось расшифровать в присутствии антибиотика стрептолидигина ( Vassylyev et al., 2007b ). Основание нуклеотида в преинсерционном сайте занимает то же положение, что и в инсерционном сайте, но остаток рибозы вывернут в сторону от активного центра ( Рис. 4.6 А) и его позиция перекрывается с положением G-петли в полностью свернутом состоянии ( Рис. 4.6 Б). Переход субстрата в инсерционный сайт сопровождается полным сворачиванием G-петли, остатки M1238 и Н1242 взаимодействуют с входящим нуклеотидом ( Рис. 4.6 Б) ( Vassylyev et al., 2007b ; Wang et al., 2006 ). После присоединения нуклеотида происходит новое изменение конформации G-петли, в результате чего она переходит в "заклиненное" (wedged) состояние ( Рис. 4.6 В). Данную конформацию удалось зафиксировать в ЭК РНКП II S. cerevisiae в присутствии ингибитора эукариотической РНКП альфа-аманитина ( Brueckner and Cramer, 2008 ). Высказывается гипотеза, что переход G- петли в заклиненную конформацию может запускаться высвобождением пирофосфата после присоединения нуклеотида. В заклиненном состоянии ближайшая к активному центру спираль в основании G-петли (в частности, остаток Leu1081, соответствующий Met1238 в РНКП T. thermophilus), взаимодействует с F-спиралью, при этом нарушается альфа-спиральная конформация центральной части F-спирали, которая приближается к активному центру РНКП ( Рис. 4.6 Г). Данная конформация G-петли, по- видимому, играет роль в транслокации РНКП после присоединения нуклеотида.
