Различия в структуре контактов РНКП бактерий с промотором
Различия в структуре контактов РНКП E. coli и T. aquaticus с промотором.
Трехмерная структура РНК-полимеразы (РНКП) E. coli и структура транскрипционных комплексов этой РНКП на сегодняшний день остаются неизвестны. Вместе с тем можно предполагать, что структура контактов РНКП E. coli с нуклеиновыми кислотами (в частности, в промоторном комплексе ) может существенно отличаться от РНКП T. aquaticus и T. thermophilus. Для выявления структурных различий между промоторными комплексами РНКП Е. соli и T. aquaticus был использовн метод формальдегид-индуцированных ДНК-белковых сшивок, который позволяет детектировать тесные контакты РНКП с ДНК в расплавленной области промотора ( Brodolin et al., 2000 ). На Рис. 4.6 показаны результаты эксперимента по образованию ковалентных сшивок РНКП с радиоактивно- меченым фрагментом ДНК, содержащим lacUV5-промотор, при разных температурах; количественный анализ данных приведен на Рис. 4.7 .
В случае холофермента Е. соli сшивку с промоторной ДНК образуют бета'- и сигма70-субъединицы РНКП ( Brodolin et al., 2000 ); кор-фермент сшивки не образует ( Рис. 4.6 А). Эффективность сшивки холофермента возрастает при повышении температуры, достигая максимума при 60 градусов по С ( Рис. 4.7 ). При более высокой температуре сшивка исчезает, что, вероятно, связано с денатурацией РНКП и разрушением открытого комплекса .
У гибридного холофермента, состоящего из кор-фермента Е. соli и сигмаA-субъединицы T. aquaticus, картина сшивки с промотором оказывается очень похожей на холофермент Е. соli ( Рис. 4.6 ). Сшивка также образуется с бета'- и сигма-субъединицами РНКП, и ее эффективность примерно соответствует эффективности сшивки в случае РНКП Е. соli ( Рис. 4.6 А, Рис. 4.7 ). Следовательно, общая архитектура контактов с расплавленной областью промотора РНКП, содержащих кор-фермент Е. соli и различные сигма-субъединицы, оказывается очень похожей. Однако, в отличие от холофермента Е. соli, гибридная РНКП не образует сшивки с промотором при низкой температуре (до 30 градусов).
Совершенно иная картина ДНК-белковых контактов наблюдается в промоторных комплексах РНКП T. aquaticus. В данном случае сшивка образуется с бета-субъединицей РНКП, а бета'- и сигма-субъединицы сшивки не образуют ( Рис. 4.6 Б). Сшивка в промоторном комплексе РНКП T. aquaticus происходит при температурах выше 37 градусов. При дальнейшем повышении температуры ее эффективность резко увеличивается и достигает при 70градусах 50% ( Рис. 4.6 Б, Рис. 4.7 ).
Гибридный холофермент, содержащий кор-фермент T. aquaticus и сигма70-субъединицу Е. соli, не образует сшивки с промотором ни при каких температурах ( Рис. 4.6 Б). Таким образом, данная РНКП не способна формировать открытый комплекс на lacUV5-промоторе. Что согласуется с ранее опубликованными данными о неспособности сигма70 активировать кор- фермент T. aquaticus в тестах по транскрипции in vitro ( Kuznedelov et al., 2003 ; Minakhin et al., 2001 ).
Следует подчеркнуть, что различия в картине сшивки РНКП Е. соli и T. aquaticus объясняются именно различиями в структуре открытого комплекса , а не различиями аминокислотных последовательностей контактирующих с ДНК участков белка. Так, сигма-субъединица T. aquaticus не образует сшивки с промотором в случае холофермента T. aquaticus, но образует сшивку в составе гибридной РНКП, содержащей кор-фермент Е. соli. Из этого следует, что именно кор-фермент определяет специфическую конформацию сигма-субъединицы и структуру контактов РНКП с промотором. Эффективность сшивки также определяется кор-ферментом и не меняется в зависимости от того, какая сигма-субъединица входит в состав РНКП. Максимальная эффективность сшивки РНКП Е. соli и гибридного холофермента при температуре 50-60 градусов составляет всего несколько процентов. РНКП T. aquaticus в тех же условиях образует сшивку с исключительно высокой эффективностью (порядка 50%), что, вероятно, свидетельствует о наличии плотных ДНК-белковых контактов. Такие контакты вероятно необходимы для поддержания структуры промоторных комплексов при высоких температурах.
Исследование температурной зависимости формальдегидной сшивки показывает, что образование сшивки в промоторных комплексах разных полимераз происходит при тех же температурах, что и плавление ДНК в районе стартовой точки транскрипции при образовании открытого комплекса. Так, сшивку с ДНК в промоторных комплексах РНКП Е. соli удается зафиксировать при температурах от 20 градусов, в то время как РНКП T. aquaticus и гибридный холофермент образуют сшивку только при температуре выше 37 градусов. Следовательно, температурная зависимость образования сшивки соответствует температурной зависимости открывания промоторов РНКП (см. Открывание промоторов РНКП мезофильных и термофильных бактерий ).
Таким образом, метод формальдегидной сшивки позволяет с большой специфичностью детектировать плавление ДНК при образовании открытого промоторного комплекса и обнаруживать структурные различия промоторных комплексов разных РНКП, не выявляемые другими методами. Этот метод может быть использован в дальнейшем при исследовании механизмов открывания промоторов и при анализе различий в структуре промоторных комплексов РНКП разных бактерий.
