Рифампицин: нарушение связывания каталитических ионов Mg2+
Рифампицин - высокоэффективный антибиотик широкого спектра действия, который применяется в терапии различных инфекционных заболеваний, в том числе туберкулеза. Рифампицин относится к группе ансамицинов - соединений, содержащих в своем составе 17-членную ненасыщенную "анса-цепь" ( Рис. 5.10 А). Другими антибиотиками этой группы являются рифапентин , рифабутин и рифамексил , которые отличаются по структуре заместителей в 3,4-положениях анса-цепи ( Рис. 5.10 А).
Различные антибиотики рифампицинового ряда получили общее название рифамицинов. Высокая эффективность действия рифампицина и его производных связана с их способностью ингибировать процесс транскрипции в бактериальной клетке. Клеточной мишенью рифампицина является РНК- полимераза (РНКП) ( Hartmann et al., 1967 ). Первоначальные исследования влияния рифампицина на транскрипцию показали, что он блокирует стадию инициации транскрипции, препятствуя синтезу РНК длиннее динуклеотида ( Handschin and Wehrli, 1976 ; Hinkle et al., 1972 ; McClure and Cech, 1978 ; Yarbrough et al., 1976 ). В случае использования коротких динуклеотидных РНК-затравок, лишенных 5'-трифосфатной группы, РНКП в присутствии рифампицина способна синтезировать более длинные тринуклеотидные РНК-продукты ( Campbell et al., 2001 ).
Анализ структуры комплекса РНКП T. aquaticus и T. thermophilus c рифампицином показал, что рифампицин связывается недалеко от активного центра РНКП в белковом кармане, образованном бета-субъединицей ( Рис. 5.10 Б) ( Artsimovitch et al., 2005 ; Campbell et al., 2001 ). Все известные мутации устойчивости к рифампицину, обнаруженные в РНКП различных бактерий, локализуются в четырех районах в бета-субъединице РНКП ( Jin and Gross, 1988 ; Lisitsyn et al., 1984a ; Lisitsyn et al., 1984b ; Ovchinnikov et al., 1983 ; Severinov et al., 1993 ; Severinov et al., 1994b ). Аминокислотные остатки, замены которых приводят к рифампицин-устойчивости, сгруппированы в пространстве в области рифампицин-связывающего кармана. Часть этих остатков образует непосредственные контакты с рифампицином, а оставшиеся окружают рифампициновый карман, но не контактируют с антибиотиком напрямую.
Так как рифампицин связывается рядом с активным центром , на пути синтезируемой РНК, было предположено, что ингибирование транскрипции, вероятно, происходит в результате стерического блокирования антибиотиком канала выхода РНК ( Рис. 5.11 А). Однако, более подробное исследование механизма действия антибиотика показало, что рифампицин способен также непосредственно воздействовать на структуру активного центра РНКП ( Artsimovitch et al., 2005 ). Наиболее важным изменением в структуре активного центра РНКП, происходящим при связывании рифампицина, является потеря каталитического иона магния MgI. Отсутствие данного иона было зафиксировано во всех расшифрованных структурах комплексов РНКП с рифампицином и его производными ( Artsimovitch et al., 2005 ; Campbell et al., 2001 ). Было также установлено, что повышение концентрации магния в окружающей среде повышает уровень устойчивости бактерий к рифампицину ( Artsimovitch et al., 2005 ). На основании этих фактов было предположено, что рифампицин может вызывать аллостерические изменения в структуре активного центра приводящие, в частности, к потере ионов магния ( Artsimovitch et al., 2005 ).
Результатом этих изменений может являться снижение скорости катализа, а также нарушение связывания нуклеотидных субстратов в активном центре. Действительно, ранее было установлено, что рифампицин в несколько раз повышает КМ для инициаторных субстратов ( McClure and Cech, 1978 ).
Возможный путь передачи сигнала от сайта связывания рифампицина в активный центр изображен на Рис. 5.11 Б. В передаче сигнала могут быть задействованы несколько остатков бета-субъединицы, которые изображены на рисунке зеленым цветом. Замена одного из этих остатков (L1235, нумерация E. coli) действительно приводит к слабой устойчивости РНКП к рифампицину, что служит свидетельством в пользу данного механизма ( Artsimovitch et al., 2005 ).
Еще один путь передачи сигнала от рифампициновых антибиотиков в активный центр может обеспечивать сигма-субъединица РНКП. Как было установлено, рифабутин , в отличие от рифампицина, способен полностью ингибировать образование и динуклеотида, и тринуклеотида РНК (при инициации транскрипции с использованием динуклеотидной затравки) ( Рис. 5.12 А) ( Artsimovitch et al., 2005 ). В комплексе с холоферментом РНКП боковая группа рифабутина образует дополнительные связи с заряженными остатками в петле, образованной районом 3.2 сигма- субъединицы ( Рис. 5.12 Б). Делеция этой петли в сигма-субъединице приводит к исчезновению ингибирующего действия рифабутина на синтеза тринуклеотида ( Artsimovitch et al., 2005 ). Таким образом, вероятно, что взаимодействие рифабутина с районом 3.2 сигма может каким-то образом приводить к изменениям в структуре активного центра РНКП.
