Сигма-субъединица: инициация синтеза РНК
Роль сигма-субъединицы в инициации синтеза РНК.
Важнейшим отличием РНК-полимераз (РНКП) от ДНК-полимераз является способность РНКП к инициации синтеза de novo, то есть в отсутствие затравки.
Известно, что
- в непосредственной близости от активного центра фермента располагается белковая петля, образованная районом 3.2 сигма-субъединицы ( Рис. 5.1 ) ( Murakami et al., 2002a ; Vassylyev et al., 2002 );
- 5'-конец синтезируемого РНК-транскрипта может контактировать с сигма-субъединицей в процессе инициации ( Markovtsov et al., 1996 ; Severinov et al., 1994a );
- точечные мутации в районе 3.2 сигма-субъединицы влияют на инициацию синтеза РНК, абортивную транскрипцию и уход РНКП с промотора ( Hernandez et al., 1996 ).
Все это позволяет предположить, что район 3.2 сигма-субъединицы может принимать непосредственное участие в инициации синтеза РНК ( Murakami and Darst, 2003 ; Murakami et al., 2002a ; Vassylyev et al., 2002 ; Young et al., 2002 ).
Для проверки этой гипотезы была получена сигма70-субъединица E. coli с делецией аминокислот 513-519 (DDEDSHL) в центральной части петли, образованной районом 3.2 ( Рис. 5.1 ). Сравнительный анализ транскрипционных свойств РНК-полимеразы дикого типа и мутантной РНК- полимеразы показал практически полное отсутствие активности у РНКП с делецией дельта513-519 ( Рис. 5.2 А). Показано также, что мутация не влияет на открывание промотора ( Рис. 5.2 Б). Следовательно, отсутствие активности у мутантной РНКП не связано с нарушением открывания промотора и должно объясняться дефектами непосредственно в инициации синтеза РНК.
Для проверки этого предположения была измерена активность РНКП E. coli с сигма дельта513-519 в присутствии динуклеотидной затравки, соответствующей стартовой точке транскрипции ( Рис. 5.2 ). Наличие затравки значительно стимулировало активность мутантной РНКП, которая в этих условиях становилась сравнимой с активностью РНКП дикого типа ( Рис. 5.2 А). Таким образом, эффект мутации должен быть связан с нарушением связывания инициаторных NTP и образования первой фосфодиэфирной связи в ходе инициации.
Анализ влияния делеции в районе 3.2 сигма на связывание субстратов показал, что делеция практически не влияет на связывание 5'- инициаторного нуклеотида (AТР) ( Рис. 5.3 ). Что согласуется с литературными данными о том, что сайт связывания 5'-инициаторного нуклеотида полностью сформирован кор-ферментом РНКП ( Naryshkina et al., 2001 ). В то же время было показано, что район 3.2 сигма-субъединицы стимулирует связывание 3'-инициаторного нуклеотида в активном центре РНКП ( Рис. 5.3 ).
Анализ трехмерной структуры холофермента РНКП T. thermophilus и существующих моделей промоторного комплекса, полученных на основе данной структуры, показывает, что район 3.2 сигма-субъединицы, хотя и находится поблизости, но непосредственно не контактирует с 3'-инициаторным нуклеотидом в активном центре РНКП ( Рис. 5.1 ). Таким образом, можно предположить, что данный район сигма-субъединицы влияет на структуру активного центра РНКП по аллостерическому механизму, способствуя формированию сайта связывания нуклеотидов.
