Стимуляция ДНК-связывающей активности сигма-субъединицы
Стимуляция ДНК-связывающей активности сигма-субъединицы кор-ферментом РНК-полимеразы (РНКП).
Для анализа стимуляции ДНК-связывающей активности сигма- субъединицы кор-ферментом РНКП было изучено взаимодействие РНКП E. coli с короткими "нематричными" олигонуклеотидами, соответствующими нематричной цепи промотора и содержащими -10 элемент (ТAТAAТ) ( Рис. 2.2 А). Известно, что узнавание -10 элемента в составе нематричных олигонуклеотидов холоферментом РНКП во многом напоминает узнавание -10 элемента в природных промоторах ( Marr and Roberts, 1997 ; Savinkova et al., 1988 ).
Для детекции образования комплексов РНКП с нематричными олигонуклеотидами был использован метод ковалентных ДНК-белковых сшивок. Было показано, что свободная сигма70-субъединица РНКП E. coli не образует ковалентной сшивки с нематричным олигонуклеотидом при облучении ультрафиолетовым светом (длина волны 254 нм) ( Рис. 2.2 Б, дор. 5 и 10). Таким образом, в соответствии с опубликованными данными ( Marr and Roberts, 1997 ; Savinkova et al., 1988 ), свободная сигма70- субъединица не способна эффективно узнавать -10 элемент промотора в составе нематричных олигонуклеотидов. В то же время, сигма70 в составе холофермента образует сшивку с нематричным олигонуклеотидом (дор. 2); сшивка является специфичной и не образуется в случае контрольного комплементарного олигонуклеотида (дор. 7). Следовательно, кор-фермент E. coli стимулирует специфическое узнавание нематричного олигонуклеотида сигма-субъединицей.
Локализация места сшивки олигонуклеотида с сигма-субъединицей была определена методом ограниченного химического расщепления модифицированного белка по остаткам метионина ( Grachev et al., 1989 ). Суть метода в следующем. Белок, содержащий радиоактивную метку в уникальном сайте, расщепляют по остаткам метионина (при обработки BrCN) в условиях одноударной реакции, в результате чего образуются два набора радиоактивно-меченых пептидов, содержащих N- или С-концевую часть исходного белка. Так как относительная подвижность этих пептидов при проведении гель-электрофореза в денатурирующих условиях соответствует размеру пептидов, их идентифицируют сравнением экспериментальной картины распределения длин полученных продуктов расщепления с теоретически рассчитанным распределением N- и C-концевых фрагментов ( Рис. 2.2 Д). Расположение сайта модификации устанавливается на основании размера самого короткого меченого пептида. Самый короткий радиоактивно-меченый пептид, полученный в результате расщепления комплекса сигма70- субъединицы с нематричным олигонуклеотидом, соответствует С-концевому фрагменту, получающемуся при расщеплении сигма по остатку Met413 ( Рис. 2.2 Е). Следовательно, сайт модификации локализуется между аминокислотами Met413 и Met456 (следующий после Met413 остаток метионина). Этот участок соответствует консервативному району 2 сигма70, участвующем в узнавании -10 элемента в природных промоторах. Таким образом, метод сшивки позволяет зафиксировать функционально-важные взаимодействия -10 элемента промотора с районом 2 сигма-субъединицы.
Чтобы установить, какая из субъединиц кор-фермента важна для стимуляции связывания ДНК сигма-субъединицей, провели эксперименты по сшивке в присутствии изолированных бета'- и бета-субъединиц кор-фермента . Бета'- и бета-субъединицы были экспрессированы в клетках бактерий, выделены и очищены до гомогенного состояния. Обнаружено, что бета'-субъединица, в отличие от бета-субъединицы, способна стимулировать образование ковалентной сшивки сигма-субъединицы с нематричным олигонуклеотидом ( Рис. 2.2 Б, дор. 3 и 4); в случае контрольного олигонуклеотида сшивка не образуется (дор. 8 и 9). Установлено, что для активации связывания ДНК сигма-субъединицей необходима N-концевая часть бета'-субъединицы, содержащая основной сайт связывания сигма, тогда как С-конец бета' образование сшивки не стимулирует ( Рис. 2.2 В).
При сшивке фрагментов сигма-субъединицы с нематричными олигонуклеотидами было показано, что фрагмент сигма70 1-448 (с удаленной С-концевой частью, включающей районы 2.5-4.2), как и фрагмент сигма70 94-448 (в котором удалены С-концевая часть и N-концевой район 1.1), в присутствии кор-фермента способны образовывать сшивку с олигонуклеотидами ( Рис. 2.2 Г, дор. 2 и 3). В отсутствие кор-фермента сшивка не образуется. Таким образом, районы 1.1 и 2.5-4.2 не нужны для активации узнавания ДНК сигма-субъединицы кор-ферментом РНКП. В то же время, кор-фермент не способен стимулировать сшивку с нематричным олигонуклеотидом фрагмента сигма70 102-448 с удаленной дополнительно частью района 1.2 ( Рис. 2.2 Г, дор. 4). Контрольные опыты показали, что этот фрагмент сигма сохраняет способность взаимодействовать с кор- ферментом. Поскольку район сигма 1.2 принимает участие во взаимодействиях с бета'-субъединицей кор-фермента, но не с -10 элементом промотора ( Рис. 2.1 ), можно сделать вывод, что взаимодействие района 1.2 с бета'-субъединицей стимулирует ДНК-связывающую активность района 2 сигма-субъединицы по аллостерическому механизму.
Проведенные эксперименты позволили установить, что конформационные перестройки сигма-субъединицы, активирующие узнавание -10 элемента промоторов, происходят в результате взаимодействия сигма-субъединицы с N-концом бета'-субъединицы кор-фермента РНКП. Узнавание -10 элемента может осуществляться достаточно коротким фрагментом сигма с консервативными районами 1.2 и 2.
