Структура элонгационных комплексов бактериальной РНК-полимеразы и роль G-петли
В лаборатории Д. Васильева в сотрудничестве с лабораториями И. Арцимович и Р. Лэндика была расшифрована трехмерная структура элонгационных комплексов РНКП T. thermophilus , содержащих входящий нуклеотид в инсерционном и преинсерционном сайтах ( Vassylyev et al., 2007b ). Для кристаллизации элонгационного комплекса (ЭК) с нуклеотидом в инсерционном сайте был использован негидролизуемый аналог NTP-субстрата, аденозин-5'-[(альфа,бета)-метилено]-трифосфат. Анализ структуры ЭК с нуклеотидом в преинсерционном сайте был проведен в присутствии антибиотика стрептолидигина , который фиксирует данное состояние.
Структура ЭК, содержащего нуклеотид в инсерционном сайте, приведена на Рис. 4.4 . Анализ данной структуры показал, что входящий нуклеотид участвует в стэкинг-взаимодействиях с 3'-концевым нуклеотидом РНК; при этом положение нуклеотида в точности соответствует A-форме РНК- ДНК гибрида, удлиняя его на одну пару нуклеотидов. В правильном связывании нуклеотидного субстрата в активном центре решающую роль играют два структурных элемента бета'-субъединицы: F-спираль и G-петля ( Рис. 4.3 и Рис. 4.4 ). Изменение структуры G-петли в присутствии нуклеотида является наиболее заметным изменением в структуре РНКП по сравнению с элонгационным комплексом (ЭК), не содержащим нуклеотида ( Рис. 3.5 ). В присутствии субстрата G-петля сворачивается в две альфа-спирали, которые вместе с F-спиралью образуют единую трехспиральную структуру.
Свернутая G-петля "прижимает" нуклеотид к 3'-концу РНК, в результате чего образуется "закрытая" конформация активного центра, в которой входящий нуклеотид изолирован от окружающей среды ( Рис. 4.4 ). Два аминокислотных остатка G-петли, входящие в состав ближайшей к активному центру спирали, непосредственно взаимодействуют с азотистым основанием (остаток M1238 в РНКП T. thermophilus , которому соответствует остаток Leu1081 в РНКП II S.cerevisiae) и трифосфатом (остаток Н1242 в РНКП T. thermophilus, которому соответствует остаток H1085 в РНКП II S. cerevisiae) входящего нуклеотида ( Рис. 4.5 А, Б и В). Эти остатки, вероятно, играют ключевую роль в правильном связывании нуклеотида. Действительно, ранее было показано, что замена первого из этих остатков в РНКП E. coli (остаток M932, соответствующий M1238 в РНКП T. thermophilus) нарушает каталитическую активность РНКП и увеличивает длительность транскрипционных пауз ( Toulokhonov et al., 2007 ). Замена второго из этих остатков в РНКП II S. cerevisiae (остаток H1085) приводит к сильнейшему падению каталитической активности РНКП и снижает скорость присоединения нуклеотидов примерно на два порядка ( Kaplan et al., 2008 ). К похожим эффектам приводят мутации в РНКП E. coli, нарушающие правильное сворачивание G-петли в ходе катализа ( Vassylyev et al., 2007b ).
Было обнаружено, что G-петля также играет важную роль в дискриминации субстратов. Так, замена остатка Н1085 в РНКП II S. cerevisiae в G-петле сильно снижает скорость включения рибонуклеотидов, но практически не влияет на включение дезоксирибонуклеотидов и некомплементарных субстратов ( Kaplan et al., 2008 ; Wang et al., 2006 ). Это позволило предположить, что правильность включения субстратов подвержена кинетическому контролю и обеспечивается тем, что комплементарный рибонуклеотид, который идеально подходит по структуре к сайту связывания, способствует закрыванию G-петли и катализу. Роль G-петли в дискриминации субстратов также иллюстрируется тем, что ингибитор эукариотической РНКП II альфа-аманитин , который влияет на конформацию G-петли, нарушает дискриминацию правильных и неправильных субстратов, за счет значительного снижения скорости включения комплементарных нуклеотидов ( Kaplan et al., 2008 ).
