Узнавание -10 элемента промотора сигма-субъединицей
Наличие -10 элемента в составе аптамеров показывает, что сигма способна узнавать данный элемент в отсутствие кор-фермента РНКП. Анализ мутантных вариантов аптамеров sEcap1 и sТap1 с заменами в участке -10 элемента показал, что этот элемент абсолютно необходим для связывания аптамеров с сигма-субъединицей. Так, замена A на С во втором положении - 10 элемента приводит к полному подавлению взаимодействий аптамеров sEcap1 и sТap1 с сигма-субъединицами E. coli и T. aquaticus, соответственно. Именно этот нуклеотид играет наиболее важную роль в узнавании -10 элемента и плавлении промоторов ( Schroeder et al., 2007 ). Замены в других позициях -10 элемента также нарушают связывание аптамеров ( Рис. 2.6 ).
Было установлено, что для узнавания sEcap1-аптамера достаточно фрагмента сигма70 94-448, содержащего консервативные районы 1.2 и 2 и лишенного N- и С-концевых участков ( Табл. 2.1 ). Интересно, что этот же фрагмент сигма-субъединицы способен узнавать -10 элемент в составе нематричных олигонуклеотидов только в комплексе с кор-ферментом РНКП. Это означает, что в связывание аптамеров с сигма-субъединицей, кроме специфических промоторных элементов, вероятно, вносят вклад дополнительные участки ДНК, которые делают возможным узнавание -10 элемента в отсутствие кор-фермента РНКП.
Для узнавания sTap1-аптамера сигмаA-субъединицей N-конец сигма также не требуется, так как фрагмент сигмаA 92-438 связывает аптамер с той же аффинностью, что и полноразмерная сигма-субъединица. В то же время, делеция С-концевой части сигмаA-субъединицы, соответствующей району 4.2 (в случае фрагмента сигмаA 1-390), нарушает связывание аптамера ( Табл. 2.1 ). Таким образом, район 4.2 сигмаA, по-видимому, участвует в контактах с аптамером sTap1.
При картировании участка контактов аптамера sEcap1 с сигма70- субъединицей показано, что аптамер, содержащий -10 элемент промотора, при облучении ультрафиолетовым светом (254 нм) с большой эффективностью образует сшивку с сигма70-субъединицей ( Рис. 2.5 А). Сшивка является специфичной и не образуется в случае аптамера, содержащего мутацию во втором положении -10 элемента (A на C). Сайт сшивки локализован в районе 2 сигма70, между остатками Met413 и Met456 ( Рис. 2.5 Б). В этом же районе локализуется сшивка нематричного олигонуклеотида с сигма70 в холоферменте РНКП ( Рис. 2.5 Б).
Известно, что мутации в районе 2.4 сигма70-субъединицы E. coli способны супрессировать замены в -10 элементе в природных промоторах, что подтверждает участие данного района сигма в узнавании -10 элемента ( Gross et al., 1998 ). В частности, замена остатка Gln440 на His в сигма70-субъединице значительно улучшает узнавание промоторов, содержащих мутации в первом положении -10 элемента ( Gross et al., 1998 ). В аналогичных экспериментах с sTap1 было показано, что замена первого остатка Т в -10 элементе в sTap1 приводит примерно к 100-кратному падению аффинности этого аптамера к сигмаA-субъединице T. aquaticus ( Рис. 2.6 ). Замена остатка Gln на остаток His в 260 положении в районе 2.4 сигмаA (pамена, соответствующая замене Gln440His в сигма70) не влияет на узнавание исходного аптамера, но значительно улучшает связывание мутантного варианта sTap1 ( Рис. 2.6 ). Таким образом, мутации в районе 2.4 сигма-субъединицы способны супрессировать замены в -10 элементе в аптамерах.
Известно, что в контактах с -10 элементом промотора принимают участие два абсолютно консервативных остатка Trp района 2.3 сигма- субъединицы (Trp433 и Trp434 по нумерации E. coli) ( Gross et al., 1998 ; Juang and Helmann, 1994 ; Schroeder et al., 2007 ; Tsujikawa et al., 2002 ). Для анализа участия этих остатков во взаимодействиях с аптамерами было исследовано влияние sTap1 и hEcap1 на Trp флуоресценцию сигмаA- и сигма70-субъединиц. Показано, что связывание аптамеров приводит к значительному гашению флуоресценции, в то время как неспецифические олигонуклеотиды на уровень флуоресценции не влияют ( Рис. 2.7 ). Полученные результаты указывают на существование прямых контактов остатков Trp в районе 2.3 сигма-субъединиц E. coli и T. aquaticus с аптамерами.
Следовательно, сигма-субъединица в свободном состоянии способна узнавать -10 элемент промотора в составе аптамеров. Узнавание -10 элемента в аптамерах, вероятно, происходит по тому же механизму, что и узнавание данного элемента в промоторах холоферментом РНКП.
