Узнавание TG-элемента сигма-субъединицей
Динуклеотид TG, расположенный с 5'-конца от -10 элемента в аптамерах к сигма-субъединицам E. coli и T. aquaticus, напоминает TG- элемент, присутствующий в промоторах с удлиненным -10 элементом, но, в отличие от этих промоторов, не отделен от -10 элемента дополнительным нуклеотидом ( Рис. 2.3 ). Анализ мутантных аптамеров sEcap1 и sTap1, в которые между TG и -10 элементом был внесен дополнительный нуклеотид, показал, что они сохраняют способность связываться с сигма- субъединицами. В то же время, аптамеры, не содержащие TG, не взаимодействуют с сигма ( Табл. 2.2 ). Таким образом, свободная сигма- субъединица способна узнавать TG-элемент в составе аптамеров, причем, в отличие от промоторов, где положение TG строго фиксировано, узнавание TG в аптамерах может происходить в различных позициях относительно -10 элемента. Вследствие, вероятно, определенной структурной гибкости сигма- субъединицы, позволяющей узнавать два промоторных элемента, расположенных на различных расстояниях друг от друга.
В узнавании TG-элемента в природных промоторах РНКП E. coli участвуют, по-видимому, консервативные районы 2.4 и 2.5 сигма70- субъединицы ( Barne et al., 1997 ; Sanderson et al., 2003 ). В частности, было показано, что мутации в районах 2.4 и 2.5 сигма70-субъединицы супрессируют замены в TG-элементе в промоторах ( Barne et al., 1997 ; Sanderson et al., 2003 ). Аналогично анализ структуры низкого разрешения комплекса РНКП T. aquaticus с фрагментом промотора показал, что промоторная ДНК в области TG-элемента располагается между районами 2.4 и 2.5 сигмаA-субъединицы ( Murakami et al., 2002a ). Однако, относительный вклад районов 2.4 и 2.5 сигма в узнавание TG оставался неизвестным, кроме того, было неясно, в составе какой из цепей промотора происходит узнавание TG-элемента. В отличие от промоторов, где TG находится в двунитевом состоянии, в аптамерах TG входит в состав однонитевого участка, соответствующего нематричной цепи промотора. Следовательно узнавание TG-элемента сигма-субъединицей может происходить в составе нематричной цепи промотора.
Чтобы установить возможную роль района 2.5 в узнавании TG-элемента в аптамерах, было изучено взаимодействия аптамера sEcap1 с фрагментом сигма70-субъединицы 1-448, не содержащим этот района. Обнаружено, что такой фрагмент сигма-субъединицы узнает sEcap1-аптамер с той же аффинностью, что и сигма дикого типа ( Табл. 2.2 ). Показана также зависимость узнавани sEcap1 от присутствия TG-элемента, поскольку вариант sEcap1 без TG-элемента не взаимодействует с данным фрагментом сигма-субъединицы ( Табл. 2.2 ). Таким образом, район 2.5 сигма- субъединицы не участвует в узнавании TG в аптамерах.
Для выяснения значения района 2.4 в узнавании TG-элемента в аптамерах было проверено, способны ли мутации в данном районе супрессировать замены TG-элемента в аптамерах. Установлено, что замена Gln260His в районе 2.4 сигмаA-субъединицы T. aquaticus супрессирует замену TG на CC в sEcap1-аптамере: мутантная сигма-субъединица связывает аптамер с заменой TG, в то время как сигма-субъединица дикого типа такой аптамер не связывает ( Табл. 2.2 ). Это означает,что район 2.4 сигма- субъединицы участвует в узнавании TG в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора. И, следовательно, можно предположить, что узнавание TG-элемента в составе двунитевых промоторов осуществляется по обеим цепям ДНК. Район 2.4 сигма-субъединицы, по- видимому, узнает TG в нематричной цепи промотора, что следует из данных по узнаванию TG-элемента в аптамерах. Район 2.5 сигма-субъединицы, вероятно, принимает участие в узнавании TG-элемента в матричной цепи ДНК, так как мутации в данном районе супрессируют замены TG-элемента в составе двунитевых промоторов ( Barne et al., 1997 ; Sanderson et al., 2003 ), но не влияют на его узнавание в аптамерах, не содержащих матричной цепи ДНК.
