Анализ библиотек фрагментов генов 16S рРНК
В первой части настоящей работы мы провели исследование таксономического состава бактерий поверхностного снега Антарктиды анализом библиотек клонированных фрагментов генов 16S рРНК. Такой анализ позволяет выявить лишь доминантные группы бактерий. Для более подробного описания таксономического состава микробных сообществ снега библиотеки амплифицированных фрагментов генов 16S рРНК были проанализированы методом высокопроизводительного секвенирования на платформе Иллюмина. Для проведения анализа использовали препараты тотальной ДНК, выделенные из проб, отобранных на станциях Дружная, Прогресс, Мирный и Ленинградская в ходе 55-й РАЭ и описанные в предыдущих разделах. После амплификации с универсальными праймерами фрагментов ДНК, содержащих вариабельные участки V3-V4 генов 16S рРНК, было получено около 50000 последовательностей фрагментов генов 16S рРНК для каждого из образцов, количественные показатели представлены в Табл. 8 .
Покрытие составило 93% для образцов со станции Дружная и Ленинградская, 90% для образца со станции Мирный и 76% для образца со станции Прогресс, что выше средних значений, необходимых для достоверной характеристики разнообразия в библиотеках [ 149 ].
Сравнивали результаты филогенетического анализа последовательностей генов 16S рРНК из образцов со станций Дружная и Ленинградская, полученных с помощью высокопроизводительного секвенирования, с полученными ранее данными анализа библиотек клонированных фрагментов этих генов. Оба метода давали сходные результаты на уровне классов: коэффициент корреляции представленности таксономических групп, полученных двумя методами для станции Дружная составил 0,99 (p-value < 0,05), для станции Ленинградская - 0,95 (p-value < 0,05). Однако, как видно из сравнения двух первых колонок рисунка 10 (А и Б), по результатам высокопроизводительного секвенирования произошло увеличение доли малопредставленных классов, таких как Flavobacteria , Alphaproteobacteria , Sphingobacteria , Cytophaga , и Actinobacteria , за счет уменьшения доли доминирующих Betaproteobacteria .
Далее сравнили таксономический состав бактерий в образцах со станций Дружная, Ленинградская, Мирный и Прогресс, отобранных в ходе 55-ой РАЭ ( Рис. 10 ,Б). Согласно анализу, проведенному с помощью пакета программ RDP Classifier в образцах были найдены последовательности, соответствующие 34 классам бактерий. Около 4% последовательностей в каждом образце не определялись на уровне классов, но, тем не менее, входили в домен Prokaryota. Эти последовательности могут принадлежать к еще неописанным классам бактерий. Самыми многочисленными классами во всех четырех образцах были: Alphaproteobacteria , Betaproteobacteria , Gammaproteobacteria , Deltaproteobacteria , Sphingobacteria , Flavobacteria , Cytophagia , Actinobacteria , Cyanobacteria и Chloroplast (хлоропласты эукариотических организмов; происходят от цианобактерий [ 163 ] и содержат гены 16S рРНК, которые амплифицируются универсальными бактериальными праймерами). Согласно литературным данным, представители филума Proteobacteria преобладают в составе микробных сообществ снегов на поверхности ледникового щита Гренландии [ 9 ], ледников Арктики [ 11 ] и ледников в Альпах [ 13 ]. Также было показано, что Proteobacteria обладают повышенной адаптивной способностью к выживанию при отрицательных температурах [ 50 ]. В образцах со станций Ленинградская, Дружная и Мирный преобладали Betaproteobacteria (43, 68.5, и 43%, соответственно) а Flavobacteriia были самыми многочисленными (40%) в образце на станции Прогресс. Попарное сравнение таксономического состава бактерий в образце со станции Прогресс с остальными тремя образцами при помощи расчета коэффициента корреляции Пирсона показало значительное отличие микробного разнообразия этой станции от трех других станций ( Рис. 10 ,В).
Результаты анализа таксономического состава бактерий на уровне рода представлены на Рисунке 11 ,А. В образцах со станции Дружная самыми многочисленными были последовательности представителей родов Janthinobacterium (27%), Ralstonia (15%) и Pseudomonas (11%), в образцах со станции Ленинградская - Caulobacter (12%), Acinetobacter (10%) и Comamonas (9%). На уровне родов бактерий результаты анализа фрагментов генов 16S рРНК, полученных в ходе высокопродуктивного секвенирования, хорошо коррелировали с результатами, полученными при анализе библиотек клонированных последовательностей. Коэффициент корреляции Пирсона для образцов с Дружной и Ленинградской составил 0,8 и 0,9, соответственно (p-values < 0,05). В образце со станции Мирный самыми многочисленными родами бактерий были Ralstonia (31%), Bacilariophyta (24%) и Rudaea (8%), на Прогрессе - Flavobacterium (39%), Hydrogenophaga (14%) и Ralstonia (7%). Представителей родов Janthinobacterium , Ralstonia , Pseudomonas , Caulobacter , Acinetobacter и Comamonas , как отмечено выше, часто находят в холодных местах обитания. Bacilariophyta - это диатомовая водоросль с обширным ареалом, включающим Южный океан [ 164 ]. Rudaea была ранее обнаружена в небольшом количестве в ледовых кернах Гренландии [ 165 ]. Род Flavobacterium является повсеместным и встречается во множестве экосистем, в том числе в почвах, пресной воде и др. Некоторые из представителей этого рода, например F. psychrophilum , являются паразитами рыб, живущих в полярных морях [ 166 ]. Наконец, род Hydrogenophaga , недавно выделенный в отдельный род из Pseudomonas , встречается в водных экосистемах по всему миру. Некоторые его представители, например Hydrogenophaga pseudoflava , были обнаружены молекулярными методами в холодных водоемах [ 167 ]. Таким образом, все высокопредставленные на поверхности антарктического снега роды микроорганизмов были ранее детектированы в холодных местах обитания.
Несмотря на то, что состав бактерий на уровне классов был сходен для образцов со станций Дружная, Ленинградская и Мирный, корреляции на уровне родов между проанализированными образцами не наблюдалось: коэффициент корреляции Пирсона варьировал от 0,1 для Прогресса и Ленинградской до 0,4 для Мирного и Дружной ( Рис. 11 ,Б).
Как было описано в первой части данной работы, цианобактерии отсутствовали в библиотеках клонов 16S рРНК в образцах со станций Ленинградская и Дружная, и с трудом детектировались только при амплификации специфическими праймерами. Анализ ДНК образцов методом высокопроизводительного секвенирования также показал почти полное отсутствие таких последовательностей в образцах со станций Ленинградская (0,04%) и Дружная (0,6%). Однако, 24% последовательностей со станции Мирный и 7% со станции Прогресс относились к филуму Cyanobacteria / Chloroplast . Как видно из Рисунка 6 , станции Мирный и Прогресс, в которых наблюдается большая доля цианобактериальных и хлоропластных последовательностей, находятся всего в нескольких километрах от открытой поверхности морской воды, в то время как Дружная и Ленинградская, где такие последовательности практически отсутствуют - на расстоянии около 150 км и около 400 км, соответственно. Логично предположить, что источником цианобактериальных и хлоропластных последовательностей на поверхности снега близких к воде станций являются воды Южного океана, где цианобактерии и диатомовые водоросли , содержащие хлоропласты , присутствуют в значительном количестве [ 168 ]. Цианобактерии и диатомовые водоросли могут попадать на поверхность снега из аэрозоля, который образуется над открытой поверхностью воды. Оказываясь на поверхности снега, они могут или выступать первичными продуцентами в близких к воде снежных сообществах или использоваться в качестве источника питательных веществ для снежных бактерий-резидентов.
