Анализ разнообразия спейсеров Flavobacterium psychrophilum
Анализ разнообразия спейсеров F. psychrophilum, в трех различных областях Антарктики
При сравнении выявленных CRISPR спейсеров между образцами было обнаружено три одинаковых спейсера в последовательностях кассет из образцов, собранных на станциях Прогресс и Дружная. Эти спейсеры принадлежат CRISPR кассетам с 46-нуклеотидным повтором, идентичным повтору CRISPR кассеты F. psychrophilum. Последовательности с таким повтором были найдены в образцах трех станций: Прогресс, Дружная и Ленинградская. Чтобы провести более полное сравнение спейсеров из CRISPR кассет F. psychrophilum мы разработали подход, который позволяет проанализировать разнообразие спейсеров из кассет с одинаковой последовательностью повтора. Была подобрана пара праймеров, частично комплементарных последовательности повтора CRISPR кассеты F. psychrophilum. Праймеры использовали для амплифицикации находящихся между повторами спейсеров, с использованием в качестве матрицы ДНК из снежных образцов, как показано на Рис. 16 .
Продукты амплификации были получены для трех образцов ДНК, со станций Прогресс, Дружная и Ленинградская. Отсутствие продуктов амплификации для образца со станции Мирный согласуется с отсутствием CРISPR повторов F. psychrophilum в метагеномных последовательностях из этого образца. Амплифицированные последовательности были секвенированы на платформе Иллюмина. После процедуры фильтрации было получено около 850000 спейсеров длиной 29+/-4 п.о.. Схожие спейсеры было объедены в кластеры. Один кластер объединяет спейсеры, последовательности которых различаются друг от друга менее чем на 5 нуклеотидов. В результате кластеризации было получено 8196 уникальных кластеров в трех образцах, количество кластеров варьировало от 2584 (станция Дружная), до 3822 (станция Прогресс) ( Табл. 11 ). Как было сказано ранее, в одной CRISPR кассете в геноме бактерии в среднем содержится 60 спейсеров [ 33 ]. Следовательно, в образцах трех станций может содержатся 40-60 различных штаммов F. psychrophilum с различными CRISPR кассетами.
На станции Прогресс, где представленность Flavobacterium в библиотеках фрагментов генов 16S рРНК была самой высокой, наблюдалось наибольшее разнообразие кластеров спейсеров Flavobacterium. Библиотека кластеров спейсеров на станции Прогресс была далека от насыщения ( Рис. 17 ). Таким образом, найденные нами 3822 кластера составляли лишь часть истинного разнообразия спейсеров в этом образце. Кривые насыщения библиотек кластеров со станций Ленинградская и Дружная были близки к насыщению.
Результаты сравнения кластеров спейсеров между станциями представлены в виде диаграммы Венна на Рис. 18 . Лишь 58 кластеров были найдены во всех трех библиотеках спейсеров. Процент кластеров, уникальных для каждой станции, варьировал от 66 для станции Дружная, до 92 для станции Ленинградская. Таким образом, набор спейсеров (а следовательно и штаммов) F. psychrophilum в каждой из трех исследованных точек Антарктиды в значительной степени уникален. Попарные пересечения кластеров спейсеров составили от 29% для образцов со станции Дружная и Прогресса, 7% для Дружной и Ленинградской и 3% для Прогресса и Ленинградской. Т.е. станции, расположенные ближе друг к другу (Прогресс и Дружная, расстояние 150 км) обладают более схожим составом популяции внутри вида F. psychrophilum. На уровне родов бактерий мы наблюдали противоположную картину при анализе фрагментов 16S рРНК генов - станция Прогресс была наиболее отличной от других станцией, а сообщества Ленинградской и Дружной были наиболее похожи друг на друга.
Около 1% кластеров, содержали спейсеры, последовательности которых были комплементарны спейсерам из кластеров с большим весом (большим количеством содержащихся в них спейсеров) из того же образца ( Табл. 11 ). Наличие комплементарных пар спейсеров в CRISPR кассетах было ранее продемонстрировано в экспериментах по адаптации (встраивании новых спейсеров) в CRISPR кассету E. coli [ 184 ]. Присутствие самокомплементарных спейсеров в наших данных указывает на то, что встраивания новых спейсеров в системах I-E E. coli и II-C F. psychrophilum протекает по сходному механизму.
