Анализ таксономического состава активно транскрибирующих бактерий
Препараты тотальной ДНК, приготовленные из образцов поверхностного антарктического снега, содержат генетический материал как живых активно размножающихся, так и покоящихся форм и мертвых клеток бактерий. Одним из показателей жизнеспособности бактериальных клеток может служить высокое содержание РНК, в частности, рибосомальной РНК. Чтобы выявить такие бактерии, мы создали и проанализировало библиотеку клонов кДНК, полученную с 16S рРНК снежных бактерий. Для этого из тотальной РНК, выделенной из образцов со станций Дружная и Ленинградская 55-го сезона, синтезировали кДНК, используя праймер, специфический к консервативному участку 16S рРНК, а затем амплифицировали полученные последовательности. Покрытие кДНК библиотек для станций Дружной и Ленинградской составило, соответственно, 94,4% и 96,7%. В отличие от молекул геномной ДНК, которые присутствуют в клетке в количестве нескольких копий, в живых клетках могут содержаться тысячи рибосом и, соответственно, молекул 16S рРНК . Поэтому можно ожидать непропорциональное увеличение количества в библиотеках клонов кДНК последовательностей активных бактерий, находящихся на поверхности снега [ 157 ].
Из Рис. 9 видно, что таксономический состав находящихся на поверхности снега бактерий, определенный по составу рДНК и рРНК библиотек, значительно различается и какие-либо корреляции не прослеживаются. Микроорганизмы, число которых невелико судя по анализу ДНК, могут доминировать в РНК библиотеках, таким образом, анализ последовательностей 16S рДНК не является надежным для выявления активно растущих микроорганизмов, которые могут быть выявлены путем анализа РНК.
Сводные результаты анализа образцов со станций Дружная и Ленинградская 55-го сезона показаны в Табл. 6 .
В обоих образцах присутствовали роды бактерий, детектированные в библиотеках, полученных как на основе ДНК, так и кДНК: Acinetobacter , Aquaspirillum , Caulobacter , Comamonas , Janthinobacterium , Pseudomonas , Sphingomonas и Stenotrophomonas . Роды Achromobacter , Aquabacterium , Corynebacterium , Methylobacterium и Variovorax были обнаружены при анализе библиотек клонов полученных на матрице кДНК, однако не были выявлены при анализе библиотек клонов, полученных на матрице ДНК в образцах с обеих станций.
Бактерии, последовательности ДНК которых обнаруживались среди клонов из библиотек кДНК, согласно литературным источникам, часто ассоциированы с холодными местами обитания. Так, Variovorax paradoxus может расти при низких температурах и является постоянным представителем снежных экосистем [ 7 ]. Sphingomonas , Pseudomonas , Methylobacterium , Flavisolibacter и Stenotrophomonas были многократно обнаружены на поверхности снегов и в толще ледников в Тибете [ 4 , 7 , 106 , 150 , 151 , 158 ]. Представители Corynebacterium были обнаружены в вечной мерзлоте и в антарктических почвах [ 159 , 160 ]. Aquabacterium , Aquaspirillum , Comamonas , Janthinobacterium , Acinetobacter , обнаруженные нами в обоих типах библиотек клонов были ранее детектированы в различных холодных экосистемах, например в тибетских ледниках и антарктических озерах [ 7 , 150 , 151 , 158 , 161 ]. Caulobacter , Ralstonia , Burkholderia , Curvibacter , Polaromonas , Bacillus , Pedobacter , Arthrobacter , Microbacterium и Flavobacterium , которые были обнаружены только в библиотеках клонов, полученных на матрице ДНК, ранее были детектированы на поверхности снегов и в толще ледников в Тибете и ледников Японии [ 4 , 7 , 150 , 151 ]. Mitsuria , Phaselicistis , Grimontella , и Arcicella , обнаруженные нами в библиотеках клонов, полученных на матрице ДНК, ранее не были найдены в холодных экосистемах.
Таким образом, совместный анализ библиотек клонов, полученных на матрицах ДНК и кДНК, позволяет получить более детальное представление о разнообразии бактерий на поверхности снега и о трофических уровнях в снежной экосистеме по сравнению с анализом библиотек одного типа. Анализ ДНК библиотек клонов позволяет детектировать все находящиеся на поверхности снега бактерии, и таким образом дает полное представление о таксономическом составе микроорганизмов, включая мертвых бактерий, которые могут служить источником питательных веществ для активных снежных микроорганизмов. Анализ РНК позволяет детектировать бактерии, которые, скорее всего, активны в снегу или сохраняли активность во момент депонирования из воздуха.
