Методы "омика"
В последнее десяетие появился ряд новых методов комплексного изучения микробных сообществ, включая такие как метагеномика , метатракскриптомика , метапротеомика и метаболомика . Часто в англоязычной литературе их объединяют термином "омика" на основании общей части названия [ 38 ]. Эти методы позволяют получить представление не только о таксономическом составе, но и о метаболических процессах, которые потенциально могут происходить в сообществе [ 39 ].
Метагеномика - анализ совокупной генетической информации сообщества микроорганизмов. Эра метагеномных исследований начались еще в 1985 году, когда для описания разнообразия микробных сообщества впервые применили метод создания библиотек клонов фрагментов генов 16S рРНК [ 40 ]. Впервые термин "метагеномика" был введен в 1998 году Хандельсманом при описании почвенного микробного сообщества [ 41 ]. Такой подход получил широкое распространение для описания микробного разнообразия и динамики как природных экосистем-микробиомов морской воды [ 42 ], почв [ 43 ], горячих источников [ 44 ], так и микробиомов человека [ 45 ]. Эти исследования позволили выявить тысячи новых таксонов микроорганизмов в природных экосистемах [ 42 ].
Действительно широкое распространение метагеномика получила в первом десятилетии 21-го века с появлением методов высокопродуктивного секвенирования. Этот технологический прорыв позволил исключить затратный процесс клонирования фрагментов ДНК в вектора и получать миллионы ДНК последовательностей в течение считанных дней [ 46 ]. Кроме того, методы высокопроизводительного секвенирования позволили секвенировать не только отдельные фрагменты генов 16S рРНК , но и случайные фрагменты тотальной ДНК сообщества (так называемое шотган-секвенирование, shotgut sequencing). Таким образом, современные метагеномные исследования позволяют получить информацию не только о таксономическом составе всех присутствующих в образцах микроорганизмах, но и оценить их функциональную роль, - через определение относительной представленности генов, кодирующих белки различных функциональных категорий [ 39 ]. К сожалению, у метагеномных исследований есть ряд недостатков:
1) не всегда удается отсеквенировать достаточное количество последовательностей ДНК для осуществления полной сборки геномов всех присутствующих в образце микроорганизмов;
2) не всегда возможно охарактеризовать гены, кодирующие белки с пока еще неизвестными функциями;
3) на основании метагеномных исследований зачастую невозможно установить, какой именно вид в сообществе участвует в том или ином метаболическом процессе [ 47 ].
Далеко не все гены, присутствующие в геномах микроорганизмов в сообществе, активно транскрибируются [ 46 ]. Mетатранскриптомика - это молекулярный метод, основанный на изучении активно транскрибирующихся рибосомальных и матричных РНК в сообществе. Для того, чтобы описать состав генных транскриптов сообщества, на матрице тотальной РНК сообщества проводят реакцию обратной транскрипции, после чего полученную кДНК используют для высокопроизводительного секвенирования [ 48 ]. У данного метода есть ряд ограничивающих факторов, которые вносят искажения в анализ метатранскриптомных данных:
1) РНК, в отличие от ДНК, не стабильна и быстро деградирует в окружающей среде, поэтому частичные потери неизбежны при выделении тотальной РНК сообщества (особенно это касается мРНК т.к. рРНК несколько более стабильна)
2) уровень экспрессии гена и количество соответствующего белка в клетке могут не коррелировать, поэтому результаты метатранскриптомного анализа являются лишь косвенным указанием на возможное присутствие определенного белка в клетке [ 48 , 49 ].
Наличие РНК транскриптов в клетках бактерий свидетельствует об экспрессии генов, кодирующих функциональные белки, однако не свидетельствует о реализации этих функций в сообществе. Информацию о том, какие именно белки, закодированные в геномах микроорганизмов, участвуют в реализации биохимической функции, позволяет получить метапротеомный анализ [ 38 ]. Для этого из биомассы микроорганизмов, присутствующих в образце, выделяют тотальный белковый препарат; затем разделяют белки с помощью гель-электрофореза и жидкостной хроматографии, и проводят их идентификацию методом высокоэффективной пептидной ионизации с помощью масс-спектроскопии [ 38 ]. Комбинация метагеномных, метатранскриптомных и метапротеомных методов позволяет наиболее полно охарактеризовать состав и функциональные особенности микроорганизмов в экосистеме [ 50 ].
Метаболомика - метод, основанный на характеристике метаболитов, которые производятся или потребляются в процессе биологической активности сообщества [ 51 ]. Mетаболиты - это вещества небольшой молекулярной массы, которые могут выполнять в сообществе микроорганизмов различные функции, такие как взаимодействие с другими микроорганизмами в сообществе ( сигнальные молекулы и антибиотики ), клеточный стресс-ответ ( пигменты и осмопротекторы ), повышение усвояемости питательных веществ ( сидерофоры ) и др. [ 51 ]. Анализ метаболитов проводится с помощью методов ядерно-магнитного резонанса и масс-спектрометрии [ 52 ]. Метаболомные исследования помогают лучше понять и описать физиологический потенциал микробных сообществ.
