Микоплазмы: гены семейства dnaK
Различия в способности микоплазм разных видов к синтезу БТШ в ответ на тепловой шок были выявлены методом иммуноблотинга. Некоторые микоплазмы способны к индуцибельному синтезу БТШ ( A. laidlawii , M. pneumoniae ), другие - только к конститутивному ( M. genitalium , M. fermentans ).
Предполагается, что в процессе эволюции представителей класса Mollicutes регуляторные механизмы, отвечающие за синтез БТШ, были редуцированы у различных микоплазм в разной степени ( Вонский и др., 1993 , Вонский и др., 1996 ). Для выявления генов семейства dnaK был применен метод ПЦР с вырожденными праймерами, рассчитанными на основе консервативных областей гена dnaK. Амплификация на матрицах ДНК микоплазм разных видов приводит к образованию мажорных фрагментов ожидаемой длины - 840 н. п. Этот результат подтверждает присутствие гена dnaK у микоплазм. Продукты ПЦР такого же размера получены и на матрицах ДНК Escherichia coli, Bacillus subtilis и Clostridium perfringens.
Методом гибридизационного скрининга фаговой геномной библиотеки были отобраны рекомбинантные бактериофаги, несущие полноразмерный ген dnaK A. laidlawii. Экспрессия клонированного гена микоплазмы была показана в инфицированных рекомбинантными бактериофагами клетках Е. соli. Из результатов картирования вставки следовало, что получаемый при гидролизе фаговой ДНК рестриктазой HindIII фрагмент размером 2140 н. п. должен содержать полноразмерную копию гена dnaK. Однако все попытки переклонировать соответствующий фрагмент в плазмидном векторе в Е. coli завершились неудачей. Вероятной причиной этого может быть суперэкспрессия функционально активного DnaK микоплазмы, приводящая к гибели клеток Е. coli при отсутствии ко-экспрессии белков DnaJ и GrpE ( Rockabrand, Blum, 1995 ). В последующих экспериментах фрагмент хромосомы A. laidlawii, содержащий ген dnaK, был клонирован по перекрывающимся частям в составе трех плазмид.
В структуре реконструированного фрагмента локализована ОРС, имеющая протяженность 1833 н. п. и соответствующую полноразмерному гену dnaK. Кроме того, компьютерный анализ позволяет предположить, что ген dnaK фланкирован фрагментами ОРС, обладающими гомологией с grpE и dnaJ. Гены dnaK, dnaJ и grpE у A. laidlawii расположены в виде кластера и организованы в оперон, что было подтверждено после клонирования фрагмента генома A. laidlawii размером 8.4 т. п. о., содержащего ген dnaK ( Усоскин и др., 2000 ).
