Микоплазмы: культивирование: применяемые среды
Лишь часть существующих в природе микоплазм удается вырастить на искусственных питательных средах. Несмотря на многочисленные усилия, не удалось вырастить in vitro в аксеничной культуре ни одну из фитоплазм , инфицирующих насекомых и растения. Многие культивируемые микоплазмы даже при использовании самых богатых питательных сред растут плохо, медленно. Эти трудности обусловлены тем, что у микоплазм ограничены биосинтетические возможности, поэтому при культивировании используются среды весьма сложного состава.
Бессывороточные среды определенного состава предложены только для двух микоплазм - Acholeplasma laidlawii и Mycoplasma mycoides subsp. mycoides ( табл. 2 ). Все остальные микоплазмы выращивают на средах, содержащих сыворотку крови (лошадей, КРС или кроликов), а также дрожжевой экстракт, пептон и мясные бульоны, т. е. компоненты, которые нельзя назвать вполне определенными. Среди таких неопределенных, но универсальных сред наиболее эффективными и популярными являются среда Эдварда ( табл. стр.40 ) и ее модификации ( Edward, 1953 ; Hayflick, 1965 ; Tully et al., 1979 ).
Колонии микоплазм на твердой питательной среде имеют типичные очертания: их центральная зона утолщена, часто гранулирована и проникает в глубь агара, а периферическая часть тонкая и расположена на поверхности. Диаметр колоний варьирует от 10 до 500 мкм, в среднем для большинства видов он составляет около 100 мкм ( Razin, Freundt, 1984 ).
При микробиологическом определении концентрации микоплазм используют показатель КОЕ (число колониеобразующих единиц), определяемый подсчетом колоний в толще среды с 0.3 % агара, вырастающих через 3-4 сут после обычной процедуры титрования. Такие колонии имеют вид беловатых полупрозрачных комочков.
Отсутствие роста микоплазм на богатых средах в ряде случаев связано с наличием токсичного для них компонента. Например, некоторые штаммы M. hyorhinis , которые не растут на обычных средах для культивирования микоплазм, хорошо растут на среде SP4 ( табл. стр.40 ), содержащей эмбриональную сыворотку КРС. Эта среда, исходно предложенная для культивирования спироплазм , оказалась единственной пригодной бесклеточной средой для M. hyorhinis и не менее эффективной при культивировании M. pneumoniae ( Tully et al., 1979 ). Это позволило предположить ( Gardella, Del Giudice, 1995 ), что так называемые некультивируемые штаммы микоплазм могут быть чувствительными по отношению к ингибиторам, присутствующим в сложных средах (главным образом к компонентам пептона и дрожжевого экстракта). В этой связи термины "некультивируемые" и "привередливые" имеют значение только в контексте данной культуральной системы, которая может содержать как стимуляторы, так и ингибиторы роста микоплазм.
К среде Эдварда в качестве добавочного источника энергии для "ферментирующих" микоплазм добавляют глюкозу (до 1 %), а для "неферментирующих" микоплазм, способных к гидролизу аргинина, - аргинин (до 0.02 %). Более высокие концентрации аргинина отрицательно влияют на рост микоплазм ( Leath, 1976 ; Washburn, Somerson, 1977 ).
Штаммы микоплазм, способные к сбраживанию глюкозы, хорошо растут при рН среды 8.0-8.5, а штаммы, гидролизующие аргинин или мочевину - при рН среды 6.5. При гидролизе мочевины и аргинина выделяется аммиак, что приводит к защелачиванию среды (рН достигает 8.0-8.5), и клетки при этом погибают. Для поддержания рН в допустимых пределах в среды для выращивания микоплазм вводят буферные системы ( Methods..., 1983 ).
Представителям трех родов - Mycoplasma, Ureaplasma и Spiroplasma - для роста необходимы стеролы, которые являются важным компонентом их клеточных мембран. В качестве источника стеролов и жирных кислот в средах для выращивания этих микоплазм используется сыворотка. Попытки заменить сыворотку на ее отдельные фракции или на чистые препараты стеролов и жирных кислот оказались безуспешными. Дело, вероятно, в том, что сыворотка является не только источником стеролов и жирных кислот, но и содержит белки, способные связывать токсичные для микоплазм соединения. Для успешного культивирования большинства микоплазм достаточно 5-10 % сыворотки, однако для некоторых видов необходимы более высокие концентрации - до 20 %. Ахолеплазмы, способные расти в отсутствии стеролов, хорошо размножаются и на бессывороточной среде. Рост некоторых ахолеплазм (в частности, штаммов Acholeplasma mоrиm ) ухудшается, если концентрация сыворотки превышает 5 % ( Methods..., 1983 ).
Неспособность микоплазм к биосинтезу пуринов и пиримидинов de novo обусловливает их зависимость от присутствия и среде ДНК или ее предшественников. Состав и количество компонентов сред для оптимального культивирования микоплазм варьируют для разных видов микоплазм ( Chal quest, Fabricant, 1960 ; Shepard, Lunceford, 1970 ). Все компоненты среды предварительно проверяют на способность поддерживать рост микоплазм, отсутствие токсичности.
Не исключено, что именно наличие ингибирующих компонентов в сложных средах микоплазм (а не отсутствие существенных пищевых добавок) является основной причиной некультивируемости фитоплазм . Предположение о том, что неспособность клеток фитоплазмы расти in vitro обусловлена потребностью этих микроорганизмов в анаэробных условиях, не подтвердилось. В результате экспериментов с тканевыми культурами листьев Asterum oenothera (в условиях различного содержания О2 и СO2), инфицированными фитоплазмами, не удалось обнаружить связи между изменением состава воздушной смеси и ростом фитоплазм в культуре ткани. В то же время было установлено, что фитоплазмы лучше росли в мутантных растениях, дефектных по фотосинтезу ( Sears et al., 1997 ). Видимо, фитоплазма имеет ограниченные возможности антиоксидантной защиты, поэтому ткани, не генерирующие кислород, представляют для нее более подходящую среду обитания.
Большинство микоплазм - факультативные анаэробы, поэтому при их культивировании иногда применяют газовую смесь (95 % N2 + 5 % СО2). Рост некоторых микоплазм (например, Mycoplasma mycoides subsp. mycoides , M. gallisepticum , M. hyopneumoniae ) ускоряется при аэрации ( Methods..., 1983 ). Микоплазмы, колонизирующие пищеварительный тракт жвачных животных (Anaeroplasma, Asteroleplasma), являются строгими анаэробами, весьма чувствительными к кислороду, а некоторые микоплазмы (например, M. hyorhinis ), напротив, нуждаются в аэробных условиях ( Gardella, Del Giudice, 1995 ). Эти данные указывают на различия систем антиоксидантной защиты у микоплазм разных видов.
