Микоплазмы: методы выявления: ПЦР
Техника полимеразной цепной реакции (ПЦР) основана на повторяющихся циклах денатурации матричной ДНК, отжиге с праймерами-олигонуклеотидами и синтезе новых цепей ДНК с участием термостабильного фермента, Taq-или Tth-полимеразы. В результате каждого цикла число молекул ДНК удваивается, благодаря чему чувствительность метода позволяет достоверно и специфично выявлять присутствие в пробе даже единичных клеток. На основе ПЦР разработаны тесты для выявления микоплазменных заражений клеточных культур. Нуклеотидные последовательности генов 16S РНК многих прокариот (в том числе микоплазм) секвенированы и используются для филогенетического анализа и таксономии микроорганизмов ( Weisburg et al., 1989 ; Razin, 1991 ; Uphoff, Drexler, 1999 ). Высокий уровень консерватизма этих генов позволил предложить универсальные праймеры для выявления методом ПЦР микоплазменной (или любой другой прокариотной) ДНК на фоне значительных количеств ДНК эукариотных клеток ( Жуланова и др., 1993 ; Harasawa et al., 1993 ; Veilleux et al., 1996 ; Говорун, 1999 ).
Главными критериями при выборе праймеров на основе известных последовательностей генов рРНК микоплазм являются:
1) минимальная гомология с нуклеотидными последовательностями генов эукариотной 18S рРНК;
2) максимальная гомология со всеми последовательностями генов 16S рРНК прокариот;
3) отсутствие комплементарности между праймерами, а также отсутствие областей самокомплементарности внутри праймеров ( Жуланова и др., 1993 ).
В соответствии с этими критериями были выбраны праймеры 16L и 16R ( табл. 14 ).
На рис. 40 ,а представлена электрофореграмма продуктов амплификации ДНК разных микоплазм с этими праймерами. Размеры амплифицированных фрагментов соответствуют ожидаемым (около 1000 п. о.) и не различаются для разных микоплазм в пределах точности измерения. Амплификаты такого же размера получены на ДНК бактерий родов Escherishia, Staphylococcus, Klebsiella. ПЦР на препаратах эукариотной ДНК, выделенной из культур клеток человека, а также мартышки или мыши, не приводила к образованию продуктов амплификации даже при увеличении количества ДНК в пробе до 100 нг. Контрольные варианты ПЦР с праймерами 18L и 18R, рассчитанными для амплификации фрагмента гена эукариотной 18S рРНК, давали продукты ожидаемого размера (560 п. о.) на ДНК человека, мартышки и мыши, но не давали продуктов амплификации на ДНК микоплазм и бактерий. Таким образом, пара праймеров 16L-16R пригодна для выявления ДНК микоплазмы любого вида на фоне больших количеств эукариотной ДНК.
Праймеры 16L-16R были использованы в опытах с тестированием монослойных культур клеток Vero, контаминированных искусственно (M. arginini, A. laidlawii) и спонтанно (неидентифицированная микоплазма). ПЦР проводили с ДНК в составе грубых клеточных лизатов. Параллельно культуры анализировали методом окраски Hoechst 33258 и микробиологическим высевом на жидкие и твердые питательные среды. Множественность заражения этих культур, по результатам микробиологического высева, варьировала в пределах 0.1-1 КОЕ на клетку. В качестве контроля использовали чистые клетки Vero. Другая пара универсальных праймеров (16-021-16-802) ( табл. 14 ), также предназначенных для выявления генов прокариотной, в том числе микоплазменной 16S рРНК, позволяет получить продукт амплификации размером 780 п. о. ( Veilleux et al., 1996 ).
Для шести видов микоплазм обнаружены различия в длине спейсерных участков между генами 16S и 23S РНК ( Uemori et al., 1992 ) Последовательности, соответствующие этим спенсерам, депонированы в банке данных EMBL под номерами, указанными в квадратных скобках: M. fermentans PG18 [Х58553] M. hyorhinis BTS7 [Х58555], M. orale 19299 [Х58556], M. salivarium PG20 [X58558], M. hominis PG21 [X58559] и M. arginini G230 [X58560].
Рассчитаны 20-членные праймеры 16spL (локализован в гене 16S рРНК в 12 п. о. от границы спенсера 16S-23S рДНК) и 23spR (ген 23S рРНК, в 46 п. о. от границы спенсера), соответствующие консервативным участкам рДНК ( Жуланова и др., 1993 ). Амплифицируемый с помощью этих праймеров фрагмент включал кроме спенсера дополнительные 98 п. о. С учетом этого по размерам амплификатов возможно определение размера спейсеров 16S-23S у микоплазм. На рис. 40 ,б представлены продукты амплификации ДНК 7 микоплазм (в том числе 5 микоплазм, обычно контаминирующих клеточные культуры - дорожки 2-6) с праймерами 16spL и 23spR и длины спейсерных участков, вычисленные по размерам мажорных амплификатов. Различия в длине спейсерных участков между генами 16S и 23S рРНК и в их первичной структуре, выявляемые на амплифицируемых фрагментах по сайтам соответствующих рестриктаз, могут быть использованы для идентификации вида микоплазмы.
Однако для практического использования при работе с культурами клеток этот способ идентификации нельзя признать простым и удобным, так как различия в размерах спейсеров микоплазм, обычно контаминирующих клеточные культуры, находятся в пределах 205-270 п. о., а размеры амплифицируемых фрагментов - 305-370 п. о. ( рис. 40, б ). Для определения различий в электрофоретической подвижности фрагментов ДНК таких размеров требуется соответствующий маркер молекулярных весов и полиакриламидный гель, что увеличивает время проведения эксперимента.
С целью повышения надежности метода выявления микоплазм были предложены праймеры для проведения двухступенчатого (гнездового) варианта ПЦР ( Harasawa et al., 1993 ). Чувствительность метода в этом варианте составляет не менее 10 микоплазм в 10 мкл культуральной жидкости, а специфичность, обеспечиваемая второй ступенью реакции, позволяет вьывлять только микоплазмы, например на фоне ДНК Е. coli и В. subtilis. Авторы рекомендуют проводить первую ступень реакции (праймеры F1 и R1) в объеме 100 мкл с 10 мкл культуральной жидкости, а вторую ступень (праймеры F2 и R2) - с 1 мкл амплификата первой ступени ( Harasawa et al., 1993 ). Структура этих праймеров и расчетные размеры амплифицируемых фрагментов ДНК приведены в табл. 14 .
Варианты метода ПЦР рекомендуются для выявления микоплазменных контаминации клеточных культур на начальной стадии инфекции, когда чувствительность более простых методов окрашивания интеркалирующими флюорохромами оказывается недостаточной. Однако успешное проведение анализа методом ПЦР требует специализированной лаборатории.
