Микоплазмы: методы выявления: с флюорохромами
В группе методов, основанных на выявлении ДНК с помощью интеркалирующих флюорохромов, чаще всего используют краситель бисбензимид (Hoechst 33258) ( Chen, 1971 ) или краситель 4'-6-диамино-2- фенилидол (DAPI), реже - интеркалирующий антибиотик оливомицин ( Михайлова и др., 1982 ). Эти флуоресиентные красители быстро связываются с ДНК, образуя стабильные комплексы. Для окрашивания анализируемые клетки выращивают на покровных стеклах в течение 2-3 сут, затем фиксируют, подсушивают на воздухе, наносят каплю раствора красителя, через 10-15 мин промывают и просматривают под флюоресцентным микроскопом.
В контаминированных культурах микоплазмы обнаруживаются в виде отдельных мелких (0.1-0.3 мкм диаметром) гранул, а также их скоплений, расположенных вне клеток или на их поверхности. На препаратах клеток, свободных от микоплазм, наблюдается флуоресценция ядер, а цитоплазма почти не светится. Флуоресценция ДНК митохондрий в условиях окрашивания, рекомендуемых для выявления микоплазм, практически незаметна. При определенных навыках эти методы позволяют обнаруживать микоплазмы даже в случае сравнительно низкой множественности инфекции. Окраска флюорохромами оказывается особенно эффективной при уровне зараженности, соответствующем 105 микоплазм на 1 мл культуральной среды (и выше). Непосредственная подготовка препаратов занимает не более часа. Окраску флюорохромами рекомендуют как метод экспресс-диагностики микоплазменных заражений ( Drexler, Uphoff, 2000 ).
Недостатками метода являются неизбежная субъективность количественной оценки степени зараженности, а также возможность артефактов за счет флуоресценции обломков клеточных ядер и фонового свечения, которое оказывается особенно значительным при культивировании клеток в присутствии антибиотиков. Кроме того, методы, основанные на окрашивании ДНК, практически неприменимы к клеткам с относительно крупными ядрами и тонким "ободком" цитоплазмы (например, лимфоцитам). В таких случаях нужно использовать индикаторные культуры (например, мышиные фибробласты ЗТ6 или клетки почки обезьяны - Vero), которые после предварительной проверки на отсутствие микоплазм инкубируют несколько суток с ростовой средой тестируемой культуры (например, лимфоцитов) и только затем анализируют ( McGarrity, Barile, 1983 ).
