МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕЙ: МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ
Несмотря на то, что неопровержимые доказательства существования у дрожжей и дрожжеподобных организмов гранул, не отличимых по своей структуре от митохондрий высших организмов, были получены с помощью светооптической и электронной микроскопии уже давно (см. выше), выделение функционально полноценных митохондрий стало возможным лишь в 60-х годах [см. Котельникова ea 1973 ], т. е. через 20 лет после выделения нативных митохондрий из животных тканей и через 10 лет после получения интактных растительных митохондрий. Основная причина такого отставания кроется в наличии у дрожжей чрезвычайно прочной клеточной стенки и вследствие этого невозможности использования традиционных мягких методов разрушения тканей для получения интактных препаратов. Применяемые обычно методы выделения дрожжевых митохондрий основаны на двух принципах разрушения дрожжевых клеток - механическом и ферментативном. Наряду с методами, предложенными пионерами в области изучения окислительного фосфорилирования в дрожжевых митохондриях - встряхиванием клеток со стеклянными бусинками в шейкерах или высокоскоростных гомогенизаторах [см. Котельникова ea 1973 ], в последнее время широкое распространение получили способы разрушения клеток с помощью проточных дезинтеграторов с вращающимися дисками, различного рода мельниц, фракционаторов, экструзионных дезынтеграторов, гомогенизирование замороженных клеток при температуре жидкого азота, разрушение их под давлением [см. Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 , Deters ea 1976 , Deters ea 1978 , Lloyd ea 1974 , Pena ea 1977 ]. Выделение интактных органелл из гетерогенной популяции достигается многократным дифференциальным центрифугированием. Механические методы разрушения просты, универсальны, однако длительность процедуры отделения интактных митохондрий от поврежденных органелл или разрушенных фрагментов, а самое главное - низкий выход интактных структур (существует обратная зависимость между продолжительностью обработки и степенью интактности), создают определенные ограничения для использования этих методов. С помощью ферментативных методов удается лизировать клеточную стенку дрожжей под действием комплекса ферментов пищеварительного сока виноградной улитки , глузулазы , хеликазы или ферментов из бактерий и ферментов актиномицетов [см. Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 , Lloyd ea 1974 , Ohnishi ea 1966 ]. Образующиеся при этом протопласты (сферопласты) представляют собой осмотически нестабильные образования и могут быть легко разрушены с помощью осмотического шока или мягким гомогенизированием. Митохондрии, получаемые с помощью ферментативного метода, отвечают критериям физиологической интактности (они имеют почти столь же высокие величины ADP/0 и величину дыхательного контроля , как и митохондрии животных [см. Hagihara ea 1960 ]), однако широкое применение ферментативного метода ограничено тем, что даже незначительные изменения в физиологическом состоянии клеток сопровождаются появлением частичной резистентности к действию литических ферментов. Предварительная обработка клеток тиоловыми соединениями ( цистеином , 3-меркаптоэтанолом , дитиотреитолом ) в щелочной среде часто оказывается полезной для преодоления устойчивости к действию литических ферментов. Выбор наиболее оптимального варианта должен, по-видимому, определяться структурно-химическими особенностями исследуемых клеток (размеры клеток, величина и прочность клеточной стенки, ее химический состав и т. д.), а также конкретными целями исследования.
В ряде случаев очень плодотворным оказалось сочетание ферментативного и механического методов разрушения [см. Звягильская ea 1983 , Звягильская ea 1977 , Звягильская ea 1974 , Звягильcкая ea 1980 , Котельникова ea 1973 ]. При этом используется кратковременная обработка клеток хеликазой , при которой еще не происходит образования протопластов (сферопластов), но клетки имеют уже менее прочную, по сравнению с исходными, оболочку. Такие клетки, в отличие от нестабильных протопластов, устойчивы при промывании и в то же время легко разрушаются при кратковременном гомогенизировании. Выход интактных митохондрий при использовании комбинированного метода примерно в 2,5-3 раза выше, чем при механическом способе разрушения.
Очистка изолированных митохондрий Очистка изолированных митохондрий от сопутствующих примесей достигается центрифугированием в градиенте концентрации сахарозы, сорбита, перколла, зональным центрифугированием в сахарозе или флотацией в урографине, ренографине, фиколе [см. Котельникова ea 1973 , Шарышев ea 1988 , Enosawa ea 1986 , Lloyd ea 1974 , Martinez ea 1984 , Rottenberg ea 1990 , Zvjagilskaya ea 1978 ].
Митохондриальный аппарат: полиморфизм В полном соответствии с электронно-микроскопическими наблюдениями о пластичности и полиморфизме митохондриального аппарата даже в пределах одной клетки центрифугирование в градиенте плотности или зональное центрифугирование открывает бимодальное или еще более сложное распределение частиц, свидетельствующее о гетерогенности митохондриальной популяции. Анализ индивидуальных пиков показывает, что гетерогенность касается не только плотности и массы органелл, но и специфического набора маркерных ферментов, что позволяет говорить о функциональной гетерогенности дрожжевых митохондрий, отражающей, по-видимому, различия в метаболическом состоянии либо в степени дифференциации (стадии митохондриогенеза) в клетке. На ультратонких срезах морфологическая структура дрожжевых митохондрий зависит не только от систематической принадлежности, экологии и типа обмена организма, из которого они выделены, но и от состава среды выделения и суспендирования, метаболического состояния и препаративной процедуры, использованной для электронной микроскопии. Для дрожжевых митохондрий описаны те же конформационные состояния, что и для высших организмов: ортодоксальная конформация (длинные узкие кристы, расширенный матрикс, занимающий большую часть митохондриального объема) и конденсированная конформация (удлиненное нерегулярной формы межкристное пространство и высококонденсированный матрикс). В чрезвычайно конденсированных митохондриях внутренняя мембрана имеет вид длинных тубулей с образованием чрезвычайно сложной сети, напоминающей спагетти. Ортодоксальная и конденсированная конформации митохондрий связаны взаимными переходами, обусловленными степенью энергизации митохондрий. Для большей части свежевыделенных дрожжевых митохондрий характерно состояние, промежуточное между этими двумя крайними конформациями. Как правило, органеллы, выделенные в среде с добавлением высокомолекулярных стабилизаторов типа поливинилпиролидона , повторяют форму митохондрий в клетках, а без них имеют сферическую форму и увеличены в размерах. Стабилизирующий эффект поливинилпиролидона обусловлен тем, что в его присутствии уравновешивается онкотическое давление высокомолекулярных веществ, локализованных в межмембранном пространстве.
