Сукцинатдегидрогеназа (СД) растворимая
Растворимая СД восстанавливает феназинметасульфат, но не способна взаимодействовать с природным акцептором электронов - убихиноном. СД входит в состав II комплекса дыхательной цепи - сукцинат-уХ-редуктазы . Молекулярная масса СД - 100 кДа, она состоит из двух субъединиц в 70 и 27 кДА [ Ohnishi ea 1987 ]. FAD ковалентно связан с большой субъединицей через 8 альфа-группу изоаллоксазинового кольца, с остатком гистидина [ Walker ea 1972 ]. Субъединица в 27 кДа является Fe-S белком, однако и субъединица в 70 кДа содержит Fe-S кластер. Всего в СД содержится 8 атомов FeII и экви- валентное количество Sлаб. СД дрожжевых и животных митохондрий содержит три Fe-S центра, различающихся по ЭПР-спектроскопии и редокспотенциалом [ Звягильская ea 1989 , Albracht ea 1977 , Ohnishi ea 1987 ]. Подробная характеристика Fe-S цен тров приведена в разделе, посвященном комплексу II дыхательной цепи . В активном центре СД присутствует реактивная SH-группа, ответственная за торможение активности СД сульфгидрильными ингибиторами , а также одна или две молекулы аргинина [ Виноградов ea 1985 ]. Методом генной инженерии получен мутант S. cerevisiae с разрушенным геном Fe-S субъединицы СД [ Lombardo ea 1989 ]. Мутант синтезировал флавопротеиновую субъединицу СД и импортировал ее в митохондрии, но на значительно более низком уровне, чем у дрожжей дикого типа. Механизм функционирования СД рассмотрен в разделе Комплекс II дыхательной цепи .
Фермент обнаруживает удивительное сходство у всех аэробных организмов [см. Condon ea 1985 , Hederstedt ea 1981 , Maguire ea 1985 , Maguire ea 1986 , Pennoyer ea 1988 ]. Связь его с внутренней мембраной митохондрий осуществляется с помощью ионных и гидрофобных взаимодействий (точный механизм связи неизвестен); фермент может быть обратимо удален из субмитохондриальных частиц щелочной обработкой в анаэробных условиях или обработкой хаотропными агентами. FAD ковалентно связан через 8-метилгруппу изоаллоксазинового кольца с N- 3 атомом имидазольной группы гистидина большой субъединицы (70 кДа).
Большая субъединица сукцинатдегидрогеназы помимо FAD содержит и центр связывания сукцината. Существенную роль в присоединении субстрата играет SH-группа с рК 7,0, к которой сукцинат, как полагают, присоединяется полутиоацетальной связью.
ЖСЦ сукцинатдегидрогеназы. Методом ЭПР-спектроскопии в составе сукцинатдегидрогеназного комплекса митохондрий дрожжей выявлены три ЖСЦ: ЖСЦ S-l , ЖСЦ S-2 и ЖСЦ S-3 [ Albracht ea 1977 , Ohnishi ea 1975 , Ohnishi ea 1978 ] с величинами g-факторов (для S-1 и S-2 gz=2,03; gy = l,93;gx = 1,91; для S-3 g=2,01) [ Kok ea 1975 , Ohnishi ea 1975 ] и величинами потенциалов полувосстановления ( Em для S-l=0+15 мВ ; Еm для S-2= -245+15 мВ ) [ Ohnishi ea 1975 , Ohnishi ea 1978 ], близкими соответствующим характеристикам ЖСЦ животных митохондрий [ Ohnishi ea 1976 ]. ЖСЦ S-1 и S-2 парамагнитны в восстановленном состоянии (ЖСЦ S-1 может быть восстановлен сукцинатом и NAPH, S-2 - только дитионитом), ЖСЦ S-3 - парамагнитен в окисленном состоянии. По содержанию ионов железа и серы их относят: S-l к кластеру 2Fe-2S [ Albracht ea 1977 ], S-2 к кластеру 4Fe-4S [см. Ackrell ea 1984 , Singer ea 1985 ] и S-3 к кластеру 3Fe-4S [ Ackrell ea 1984 , Singer ea 1985 ], т.е. сукцинат-убихинон-редуктаза является уникальным ферментом, содержащим все три типа кластеров Fe-S . Растворимые препараты сукцинатдегидрогеназы сохраняют ЖСЦ-S-l и S-2, но теряют ЖСЦ S-3, фермент при этом теряет и способность взаимодействовать с естественным акцептором электронов - убихиноном, а также феррицианид-редуктазную активность (с # KM 1Q~4 M). Тот факт, что ЖСЦ S-3 обнаруживается лишь в препаратах, способных к реконструкции, указывает на важную роль его в качестве терминального переносчика электронов к убихинону. Растворимая сукцинатдегидрогеназа не обладает убихинон-редуктазной активностью. Для ее взаимодействия с убихиноном необходимо подключение дополнительных белков, остающихся в мембране после экстракции сукцинатдегидрогеназы [ Ackrell ea 1980 , Hatefi ea 1980 , Yu ea 1980 ]. Это небольшие полипептиды с молекулярной массой 7,5-15 кДа, весьма гидрофобные и локализованные, судя по их взаимодействию с арилазидофосфолипидами , вблизи липидного бислоя. Аминокислотная последовательность определена лишь для цитохрома b 558 , входящего в состав фумаратредуктазы В. subtilis [ Magnusson ea 1986 ] (на основании анализа нуклеотидной последовательности соответствующей открытой рамки считывания ДНК). Согласно данным [ King ea 1982 , Yu ea 1982 ], лишь один из дополнительных полипептидов с молекулярной массой ~ 15 кДа , названный авторами QPs , участвует в специфическом связывании убихинона (возможно, убисемихинона).
