Цитратсинтаза (ЦС)
Очищенная ЦС (цитратсинтаза КФ 4.1.3.7 ) была выделена из многих эукариот, в том числе и дрожжей, методом адсорбции энзима на ATP-сефарозе и элюции его субстратами реакции [ Mukkerjee ea 1976 ]. Из пекарских дрожжей ЦС выделена в фирме димера с идентичными субъединицами по 52000 Да [ Alam ea 1982 ]. Энзим дрожжей ингибируется АТР [ Alkinson ea 1968 ]. Более детально структуру ЦС пекарских дрожжей удалось установить генетическими методами, изолированием cDNA ЦС, определением нуклеотидной последовательности гена и расчетом аминокислотной последовательности в полипептиде. Был выделен ядерный ген, кодирующий митохондриальную цитратсинтазу, и рассчитана аминокислотная последовательность энзима [ Suissa ea 1984 ]. Mr предшественника ЦС равен 53419 Да, он состоял из 450 аминокислот. Позднее было показано, что препоследовательность митохондриальной ЦС содержит 39 остатков [ Rosenkranz ea 1986 ]. Найдена значительная гомология в последовательности ЦС дрожжей, сердца свиньи и Е. coli [ Suissa ea 1984 ], Установили [ Rosenkranz ea 1986 ], что cDNA S. cerevisiae содержит не один, а два гена, кодирующих две ЦС, митохондриальную и немитохондриальную - цитосольную, они названы ЦСI и ЦСII , соответственно. ЦСI и ЦСII имеют гомологию на 75%, но N - терминальная препоследовательность у них разная. У ЦСI препоследовательность из 39 остатков имеет типичную структуру сигнального пептида для направления белка в митохондрии. У ЦСII препосдедовательность составляет 20 остатков митохондриальной препоследовательности и ЦСП в митохондрии не транспортируется. Предположено, что ЦСII играет роль в глиоксилатном цикле, который локализован вне митохондрий [ Rickey ea 1986 ].
Делеция в ЦСI у дрожжевых мутантов приводили к снижению дыхания митохондрий, уменьшению активности комплексов ПД и к неспособности дрожжей расти на ацетате [ Kispal ea 1989 ]. Методом направленного мутагенеза были получены мутации в ЦСI дрожжей. У одних мутантов ЦСI отсутствовала, у других она была в неактивной форме [ Kispal ea 1989 ]. Для ЦСI сердца свиньи замена остатка Asp375 в активном центре на Asn375 или Glu375 приводила к инактивации ЦС [ Alter ea 1990 ]. Направленный точечный мутагенез в ЦС Е. coli, вызвавший замену в активном центре фермента Asp362 на Gly362, приводил к полной инактивации ЦС. Исследование парциальных реакций ЦС показало, что отсутствие активности связано с неспособностью ЦС связывать продукт реакции ацетил- СоА [ Handford ea 1988 ]. Так как ЦС дрожжей и сердца свиньи высокогомологичны [ Suissa ea 1984 ], то весьма вероятно, что эти закономерности в активном центре ЦС характерны и для дрожжей.
