Энергозависимый транспорт кальция (Ca+)
В начале 70-х годов [ Сarafoli ea 1970 , Carafoli ea 1971 , Subik ea 1970 ] при исследовании митохондрий S. cerevisiae, 8. carlsbergensis и С. utilis был сделан вывод о том, что митохондриальная Са2+- транспортирующая система дрожжей не имеет физиологического значения, поскольку характеризуется низким кажущимся сродством к иону и низкой скоростью процесса поглощения иона [ Balcavage ea 1973 , Сarafoli ea 1970 , Carafoli ea 1971 , Subik ea 1970 ]. Эта точка зрения считалась настолько общепринятой, что за 10 лет, прошедших с момента установления этого факта, не было попыток исследовать этот вопрос с привлечением более широкого круга дрожжевых организмов. Лишь в работе [ Акименко ea 1981 ] мы нашли указание на то, что митохондрии облигатного аэроба С. Hpolytica не имеют системы транспорта Са2+. Это, как будто, не оставляло сомнения в том, что характерное свойство всех дрожжевых организмов, типичная черта дрожжевого обмена. При этом, однако, оставалось неясным, почему именно в дрожжевых клетках, транспортирующих Са2+ энергозависимым способом, [ Bonitz ea 1980 , Roomans ea 1979 ] митохондрии не участвуют в поддержании Са2+- гомеостаза в цитоплазме, несмотря на очевидную важность этой функции и имеющиеся для этого возможности - наличие высокоэффективного аппарата сопряжения, генерацию трансмембранного потенциала высоких значений, а, следовательно, возможность электрофоретического поглощения Са2+. Кроме того, существенное ингибирование роста дрожжей в присутствии ионофора А23187 , действующего, как полагают, на уровне митохондриальных мембран, делало для нас не столь уж "незыблемой" устоявшуюся точку зрения о неспособности дрожжевых митохондрий участвовать в контроле внутриклеточной концентрации Са2+. В связи с этим возникла необходимость вновь исследовать систему транспорта Са2+ в дрожжевых митохондриях. Митохондриальные препараты, получаемые из End. magnusii , были особенно пригодны для такого рода исследований, поскольку сохраняли интактным аппарат сопряжения в широком диапазоне рН (6,3-7,5). В 1983 г. в совместной публикации с Н. Л. Кожокару и Ю. Н. Лейкиным [ Звягильская ea 1983 ] нам удалось впервые показать, что прочносопряженные энергизованные препараты митохондрий End. magnusii был и не только способны транспортировать ионы Са2+, но и осуществляли этот процесс со скоростями, сопоставимыми и даже превосходящими скорости транспорта Са2+ митохондриями высших организмов. На рис. 41 показаны типичные результаты регистрации поглощения Са2+ дрожжевыми митохондриями в присутствии металлохромного агента - мурексида . Процесс поглощения ионов Са2+ был энергозависимым: добавление ингибиторов переноса электронов, разобщителя окислительного фосфорилирования или в отсутствие добавленных субстратов окисления процесс транспорта существенно ингибировался. Скорость процесса не менялась при добавлении олигомицина в концентрациях, достаточных для ингибирования 3-го метаболического состояния , что исключает вклад других клеточных компонентов и АТФ-зависимых Са2+-транспортирующих систем.
ЭПР (плазменной и вакуолярной мембран) и наблюдаемые высокие величины скорости поглощения ионов Са2+ и однозначно свидетельствует о том, что они обусловлены функционированием митохондрий. Полностью совпадающие результаты были получены и при электрометрической регистрации Са2+ в суспензии митохондрий в тех же условиях с помощью Са-селективного электрода. В отличие от митохондрий растений, где поглощение ионов кальция наблюдается только в присутствии неорганического фосфата , в митохондриях дрожжей этот процесс протекал и в отсутствие проникающего аниона, что предполагало работу переносчика по механизму унипорта, как и в митохондриях животных. В этих условиях митохондрии End. magnusii могли накапливать до 1000 нмоль кальция на 1 мг белка, что на порядок превышает "кальциевую емкость" животных митохондрий в аналогичных условиях. Аномально высокая емкость дрожжевых митохондрий для ионов кальция могла быть обусловлена высоким содержанием кальций-связывающих соединений в матриксе. На это указывали эксперименты, в которых к нагруженным кальцием митохондриям добавляли ионофор А23187 при деэнергизующие агенты и наблюдали освобождение лишь части накопленного катиона [ Лейкин ea 1987 ]. Было найдено также, что активность Са2+-транспортирующей системы в дрожжевых митохондриях, в отличие от митохондрий животных, не лимитирована скоростью переноса электронов дыхательной цепи: в присутствии высоких концентраций катиона скорость дыхания составляет лишь 50% от оксидазной активности, измеренной в присутствии насыщающих концентраций разобщителя [ Лейкин ea 1987 ]. Это дало возможность оценить кинетические свойства системы. Она характеризовалась положительной кооперативностыо с величиной коэффициента Хилла, равной примерно 3 ( рис. 42 ). Анализ зависимости начальных скоростей поглощения катиона от квадрата концентрации (гипербола) ( рис. 43 ) и линеаризация в координатах двойных обратных величин дали значение KM транспортной системы и ее максимальную активность - соответственно 120-200 мкМ (несколько выше, чем для митохондрий животных при использовании того же метода регистрации транспорта и 700-1000 нмоль/мин на мг митохондриалыюго белка, что в 2-3 раза выше соответствующей максимальной активности для митохондрий животных. Сродство системы к Са2+ было значительно выше, чем к Sr2+, Ва2+ или Мп2+. Таким образом, впервые получены доказательства, что дрожжевые митохондрии (на примере митохондрий End. magmisii) обладают активной системой транспорта Са2+, причем сродство системы к иону, скорость поглощения и "емкость Са2+-резервуара" дрожжевые митохондрии не ниже, чем у митохондрий из животных тканей [ Bygrave ea 1977 , Williamson ea 1981 ].
Мы полагаем, что неудачные попытки в демонстрации энергозависимого транспорта низких концентраций Са2+ дрожжевыми митохондриями были связаны с изучением Са2+-транспортирующей системы в неоптимальных условиях (рН 6,3-7,0 вместо 7,5-7,8) и (или) использованием митохондриальных препаратов недостаточной степени интактности, с высокой степенью окисленности никотинамидадениновых коферментов.
Модуляторы Са2+ транспорта: полиамины
