ОПЭ (обратный перенос электронов) и функции митохондрий
Обнаружение обратного транспорта электронов поднимает вопрос о его возможной роли в митохондриях дрожжей. До сих пор постановка такого вопроса была бессмысленной, так как не был известен субстрат, способный индуцировать быстрое и полное восстановление внутри-митохондриального NAD(P). Кроме того, согласно установившемуся мнению, основанному, главным образом, на результатах изучения митохондрий дрожжей бродильного типа рода Saccharomyces, в дрожжевых митохондриях аспартатаминотрансфераза и обе (NAD- и NADP-зависимые) формы глутатдегидрогеназы имели внемитохондриальную локализацию [ Гогинян и др 1976 , Camadrella ea 1975 , Coffeau 1978a , Hollenberg ea 1970 ]. Следует напомнить, что в митохондриях животных ситуация прямо противоположная; глутаматдегидрогеназа локализована преимущественно в митохондриях, а аспартатаминотрансфераза - в митохондриях и цитозоле ( две различные формы фермента), обеспечивая функционирование малат- аспартатного шунта [см. Каган 1975 ].
Единственная цитозольная форма аспартатаминотрансферазы пекарских и пивных дрожжей была выделена и охарактеризована [ Coffeau 1978a , Schreiber 1964 , Yagi ea 1982 ]. Пытаясь выявить основу столь существенных различий, мы обратили внимание на то, что исследования были проведены на митохондриях дрожжей, не имеющих 1-го пункта энергетического сопряжения , а, следовательно, и обратного переноса электронов, обеспечивающего синтез глутамата восстановительными эквивалентами. Мы предположили, что отсутствие одной из основных необходимых предпосылок (восстановленных эквивалентов) для синтеза глутамата и работы глутаматдегидрогеназы могло предопределить и внемитохондриальную локализацию глутаматдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы , имеющей, как уже упоминалось, структурную связь с глутаматдегидрогеназой.
Для проверки правильности предположения исследовали метаболическую активность митохондрий и внутриклеточное распределение аминотрансфераз в клетках дрожжей В. magnusii, обладающих NADH - дегидрогеназой "животного" типа и сохраняющих 1-й пункт энергетического сопряжения на всех стадиях периодического культивирования. Найдено на основании прямого определения активности аминотрансферазы методом распределительной бумажной хроматографии и с помощью аминокислотного анализатора, что митохондрии Е. magnusii содержат высокоактивные аспартат-глутамат (прямая и обратная) и глутамат-аланин (прямая и обратная) аминотрансферазы ( табл. 9 ) [ Звигельская и др 1986 ]. Активность практически не уменьшалась после очистки митохондрий центрифугированием в градиенте перколла и флотацией с фиколлом, что исключало вклад немитохондриальных примесей в наблюдаемые высокие скорости реакции. Более того, анализ внутриклеточного распределения аминотрансферазных активностей позволил сделать вывод о том, что в дрожжах Е. magnusii, как и в клетках высших эукариотических организмов, аминотрансферазные активности распределены между митохондриями и цитоплазмой, причем некоторые из них, например глутамат-аланин- аминотрансфераза, имеют преимущественную митохондриальную локализацию.
Таким образом, впервые для митохондрий дрожжей была показана способность с высокой эффективностью осуществлять аминотрансферазные реакции. Эти данные отчетливо коррелировали с возможностью митохондрий катализировать синтез глутамата, используя восстановительные эквиваленты, образующиеся при ОПЭ (окислении a-глицерофосфата). Полученные данные позволили пересмотреть устоявшиеся в литературе представления об "уменьшенной" метаболической активности дрожжевых митохондрий и предполагают тесную связь пластического обмена с обменом энергетическим, а именно, со структурой дыхательной цепи, наличием 1-го пункта энергетического сопряжения.
Справедливость такого утверждения была проверена нами на других моделях, в первую очередь, на дрожжах Lipomyces kononenkoae , имеющих инвариантный 1 пункт энергетического сопряжения [ Tong 1989 ], и на дрожжах С. utilis , структура NADH-дегидрогеназного комплекса которых зависит от стадии роста - в логарифмической фазе роста отсутствует 1-й пункт сопряжения, чувствительность дыхания к действию ротенона и некоторые характерные ЖСЦ, и все три параметра появляются в стационарной фазе роста (см. разд. 2.2.1 ). Во всех случаях была обнаружена четкая корреляция между функционированием NADH-дегидрогеназы животного типа и способностью митохондрий катализировать синтез глутамата и осуществлять аспартат-глутамат-аминотрансферазную реакцию [ Звигельская и др 1986а , Tong 1989 ]. Более того, при выращивании С. utilis на среде с сукцинатом, приводящем к появлению 1-го пункта энергетического сопряжения на самых ранних стадиях роста, митохондрии содержали активную аспартатаминтрансферазу [ Звигельская и др 1988 ].
Наше предположение о взаимосвязи митохондриальной локализации аспартатаминотрансферазы со спецификой энергетического обмена дрожжей тоже получило подтверждение в лаборатории Т. Яги [ Yagi 1990a ].
