Измерение входа кальция в пресинаптическое нервное окончание
В ходе дальнейших экспериментов было выявлено, что проводимость мембран для ионов кальция увеличивается при деполяризации , и что кальций входит в окончание с каждым потенциалом действия. Ллинас с сотрудниками измерили амплитуду и временной ход кальциевого тока, вызываемого пресинаптической деполяризацией в гигантском синапсе кальмара . Пример такого эксперимента показан на рис. 11.З А. Натриевая и калиевая проводимости, связанные с потенциалом действия, были заблокированы ТТХ и ТЭА (тетраэтиламмонием ), следовательно, только потенциал-зависимые кальциевые каналы оставались функциональными. Деполяризация пресинаптического окончания до -18 мВ (верхняя запись слева) вызывала:
- входящий кальциевый ток в окончание, который медленно увеличивался примерно до 400 нА (средняя запись), и
- синаптический потенциал большой амплитуды в пocтсинаптической клетке (нижняя запись).
Если окончание деполяризовалось до +60 мВ, что примерно соответствует равновесному потенциалу кальция , то кальциевый ток и синаптический потенциал подавлялись во время деполяризационного толчка (см. записи справа). Это доказывает, что деполяризация пресинаптического окончания сама по себе не является достаточным условием для высвобождения медиатора - необходимо также, чтобы произошел вход ионов кальция. При реполяризации наблюдался кратковременный кальциевый ток, как если бы кальций входил через каналы, которые открылись во время деполяризации, и это сопровождалось небольшим постсинаптическим потенциалом.
Эффект искусственного потенциала действия показан на рис. 11.3 В. Пресинаптический потенциал действия, записанный до добавления ТТХ и ТЭА, был "воспроизведен" электрической цепью фиксации потенциала с тем, чтобы вызвать точно такое же изменение потенциала в окончании. Постсинаптический потенциал при этом не отличается от ответа, вызванного нормальным пресинаптическлм потенциалом действия, подтверждая тот факт, что натриевые и калиеые токи, которые в норме участвуют в генерации потенциала действия, не являются необходимым условием для высвобождения медиатора.
Использование методики фиксации потенциала позволило также измерить амплитуду и временной ход кальциевого тока, вызываемого искусственным потенциалом действия (кривая черного цвета на рис. 11.З В). Кальциевый ток начинается примерно через 0,5 мс после начала пресинаптической деполяризации, а постсинаптический потенциал начинается еще через 0,5 мс. Таким образом, время, необходимое для деполяризации пресинаптического окончания и для открывания кальциевых каналов, составляет первую половину синаптической задержки ; оставшаяся часть задержки уходит на возрастание концентрации кальция в окончании и высвобождение медиатора.
Ллинас с сотрудниками также непосредственно наблюдали вход кальция, используя экворин в качестве люминесцентной метки. Они обнаружили, чго в результате короткой серии пресинаптических потенциалов действия внутриклеточная концентрация кальция достигает от 100 до 200 мкмоль в микродоменах внутри нервного окончания ( рис. 11.4 ), которые, по всей видимости, соответствуют активным зонам ( глава 9 ).
