Какие субъединицы ацетилхолинового рецептора выстраивают пору?
Для получения информации об устройстве выстилки поры ионного канала был активно использован сайт-направленныИ мутагенез субъединиц АХР. Несмотря на наличие общих представлений о третичной структуре субъединиц АХР, наши знания о точном топологическом расположении трансмембранных сегментов и их участии в формировании стенки ионного канала более чем поверхностны. Такие характеристики исключительно важны, поскольку структура поры определяет ионную избирательность и проводимость канала. Один из подходов к решению данной проблемы состоит в проведении одной или нескольких мутаций в участке белка, предположительно вовлеченном в выстилку поры, и регистрации следующих за зтим изменений избирательности и проводимости канала.
Другой подход может базироваться на способности стенки ионного канала связывать молекулы с определенными физико-химическими свойствами. Например, молекула местного анестетика QX-222 может блокировать ток через ионный канал за счет связывания с определенным сайтом внутри открытого канала АХР. Мутации субъединиц АХР показали, что М2 домены формируют часть стенки открытого канала, как изображено на рис. 3.4 А. В частности, М2 домены альфа- и бета-субъединиц АХР мыши содержат следующие аминокислотные последовательности (направление от цитоплазмы к внеклеточной среде с нумерацией, относящейся к альфа-субъединице; рис. 3.2 ):
243 250 255 261
aльфа:MTLSISVLLSLTVFLLVIV
бета: TSVAISVLLAQSVLLLIS
Можно предположить, что гидрофильные аминокислоты, такие как серин (S) или треонин (Т), скорее всего обращены к водной поре, в то время как гидрофобный изолейцин (I) будет более вероятно контактировать с мембранными липидами . Когда серин из шестой позиции был заменен слабо гидрофобным аланином , проводимость модифицированных ионных каналов снизилась почти наполовину. Кроме того, у мутантных каналов резко снизился аффинитет для QX-222 . Эти эффекты согласуются с идеей о том, что серин образует стенку водной поры ионного канала АХР и вносит вклад в функциональные свойства ионного канала.
Предполагается, что все яыделенные на приведенном рисунке аминокислоты в составе aльфа-субъединицы принимают участие в образовании контура водной поры. Эти остатки были идентифицированы в экспериментах Карлин с коллегами, в которых каждый аминокислотный остаток альфа-субъединицы от М243 до V261 по очереди заменяли на цистеин. Мутантная альфа-субъединица была затем экспрессиривана в ооциты вместе с интактными бета-, гамма- и дельта-субъединицами. Мембранные токи, продуцируемые АХ, измерялись до и после действия гидрофильного реагента МТSЕA (этиламмония метанэтиосульфонат) . Peaгент мог избирательно реагировать с сульфгидрильной группой цистеина только в том случае, если замещенный цистеин находился в водной фазе. MTSEA ослаблял ответы на АХ (за счет блока ионного канала) в тех случаях, когда мутациям подвергались аминокислоты, выделенные на рисунке (Т244, L245, S248, L250, L251, S252, V255, L258). Эти результаты предполагают модель устройства стенки водной поры, образованной регулярной спиралью белковой молекулы, прерванной в середине вытянутой структурой, содержащей остатки 250, 251 и 252.
