Морфологическое свидетельство в пользу экзоцитоза синаптических везикул
Хеузер и Рииз изобрели методический прием, который позволил им замораживать мышцу лягушки в течение нескольких миллисекунд после одиночной стимуляции двигательного нерва с последующим исследованием с помощью методики замораживания-скалывания. В результате стало возможным получить сканирующие электронные микрофотографии везикул, запечатленных в момент слияния с пресинаптической мембраной, и с определенной долей точности определить временной ход процесса слияния.
Для этого мышца крепилась к нижней поверхности падающего поршня, причем двигательный нерв был прикреплен к стимулирующим электродам. В процессе падения поршня спускается стимулятор, раздражающий нерв с заданным временным промежутком до того, как мышца придет в соприкосновение с медным основанием, охлажденным жидким гелием до 4 градусов по Кельвину. Важной особенностью этого эксперимента является 4-аминопиридин (4-АП) , который добавляется в наружный раствор, т.к. 4-АП значительно увеличивает количество и длительность квантового высвобождения, вызванного одиночным стимулом. И, соответственно, количество открытий везикул, которые можно увидеть на электронном микроскопе ( рис. 11.17 А и В).
На основании этих экспериментов было сделано два важных вывода.
- Во-первых, наибольшее количество открываемых везикул наблюдалось в том случае, если замораживание осуществлялось через 3-5 мс после стимуляции. Это соответствует пику постсинаптического тока, регистрируемого в мышцах, обработанных кураре и 4-АП. Другими словами, максимальное количество открываний везикул по времени совпадало с пиком постсинаптического физиологического ответа.
- Во-вторых, количество открываний везикул увеличивалось при повышении концентраации 4-АП, и это увеличение было прямо пропорционально увеличивающемуся под действием 4-АП квантовому составу потенциалов концевой пластинки, который был рассчитан в элетрофиэиологических экспериментах ( рис. 11.17 С).
Таким образом количество открываний везикул коррелирует с количеством и временным ходом квантового высвобождения. В последующих экспериментах Хеузер и Рииз дали более детальное описание временного хода открывания везикул и показали, что количество открываний увеличивается в период от 3 до 6 мс после стимуляции и уменьшается в течение последующих 40 мс.
Методами флуоресцентной микроскопии также был исследован экзоцитоз на живых клетках. В этих экспериментах были помечены флуоресцентной меткой пептид-содержащие везикулы в культивируемых клетках линии PC 12 , а хромафинные гранулы - в адреномедуллярных клетках . Высвобождение катехоламинов измерялось амперометрией - методом очень высокой чувствительности, в котором микроэлектрод из угольного волокна используется для детекции медиаторов по току, возникающему при их окислении. В результате можно было наблюдать, как везикулы скапливаются у плазматической мембраны и исчезают по мере того, как их флуоресцентное содержимое высвобождается в процессе экзоцитоза ( рис. 11.18 ). Исчезновение каждой из везикул сопровождалось высвобождением кванта медиатора, регистрируемого амперометрией. Оптические флуоресцентные методы были также использованы для исследования движения везикул внутри клеток, описания того, каким образом они подходят к плазматической мембране и скапливаются около нее перед слиянием.
Таким образом, на сегодняшний день накоплены веские доказательства того, что синаптические везикулы являются морфологическим субстратом кванта медиатора и что каждая везикула содержит несколько тысяч молекул медиатора. Содержимое везикул может высвобождаться путем экзоцитоза спонтанно с низкой частотой высвобождения (вызывая миниатюрные синаптические потенциалы), а также в ответ на пресинаптическую деполяризацию. Существует и иная точка зрения [ Dunant and Israel, 1998 ], однако другие механизмы предложенные для объяснения клантового высвобождения, например, кальций-активируемые квантовые ворота в пресинаптической мембране , не получили достаточной экспериментальной поддержки. Как было замечено выше, в некоторых специализированных синапсах сетчатки деполяризация может высвобождать медиатор посредством транспортных белков в пресинаптической мембране , т.е. механизмом, который не является квантовым, не опосредован экзоцитозом везикул и не зависит от входа кальция [ Cammack and Schwartz, 1993 ., Cammack et al. 1994 ].
